食管鳞癌中mTORp70S6K信号通路的作用及其阻断策略.docVIP

食管鳞癌中mTOR/p70S6K信号通路的作用及其阻断策略 侯桂琴 ?【摘要】： 雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)信号通路在肿瘤发生发展中起重要作用，因而也越来越受到人们的关注。mTOR是一种非典型的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，属于 磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)家族。在哺乳动物中，mTOR下游有两个主要的靶分子，一个是核糖体S6激酶(S6K)，另一个是真核翻译起始因 子(eIF4E)结合蛋白1(4E-BP1)。mTOR的激活导致了S6K和4E-BP1的磷酸化，磷酸化的4E-BP1可以从帽-依赖性翻译起始因子 eIF4E上释放出来，最终增强了与细胞生长有关的基因的翻译。这两个过程也可能与其他的mTOR靶点一起增强了核糖体的生物合成及一些特殊mRNA的选 择性翻译。许多研究证明，mTOR被认为是肿瘤治疗中重要且有前景的治疗靶点，其抑制剂目前正在进行临床及临床前研究，试用于多种癌症如肾细胞癌、结肠 癌、乳腺癌、前列腺癌及小细胞肺癌等。 食管鳞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国河南省林州市(林县)，食管鳞癌的发生率及死亡率均很高。但是，mTOR及其信号通路的激活状态在食管 鳞癌中尚未见报道，这促使我们研究mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌发生发展中的作用，为治疗食管鳞癌寻找新的靶点。在本研究中，我们检测了食管 鳞癌细胞系EC9706和Eca109中mTOR及其主要下游因子的激活状态，并检测了雷帕霉素和抗mTOR的小干扰RNA(siRNA against mTOR，以下简称mTOR-siRNA)对通路中各因子mRNA及蛋白表达的影响以及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。而且，还观察了雷帕霉素和 mTOR-siRNA对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结果显示，mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌中是异常激活的，并且癌细胞的分化程度越低，激活 状态越高；另外，还证实雷帕霉素能特异性抑制mTOR／p70S6K信号通路并诱导细胞凋亡，而mTOR-siRNA不仅能抑制信号通路，还能提高细胞对 雷帕霉素和顺铂的敏感性。动物实验表明雷帕霉素和mTOR-siRNA均对肿瘤生长有明显的抑制作用，并且mTOR-siRNA与雷帕霉素联用时抑制效果 最好。最后我们从人胎盘中克隆野生型抑癌基因PTEN全基因序列，构建真核表达载体并转染食管鳞癌细胞，筛选出食管鳞癌的PTEN稳定表达株，为进一步研 究PTEN和mTOR／p70S6K信号通路之间的相互作用打下实验基础。总之，本研究探讨了mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌发生发展中的作 用，结果提示它可能是食管鳞癌药物治疗的一个有效的分子靶点。 方法 1．mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌中的激活状态 采用免疫组织化学和免疫细胞化学及Western blotting检测正常食管组织、经病理学证实的食管鳞癌组织和低分化食管鳞癌细胞株EC9706和高分化食管鳞癌细胞株Eca109中mTOR及其下 游因子p70S6K蛋白的表达；并采用RT-PCR检测食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中mTOR、p70S6K和4E-BP1的mRNA表 达。 2 mTOR／p70S6K信号通路的阻断对食管鳞癌细胞增殖、抗凋亡和耐药的影响 2．1细胞增殖及迁移能力 CCK-8试剂盒是一种与MTT类似的WST-8化合物，可用于检测细胞增殖，且比MTT的灵敏度高，因此本研究采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，观察 雷帕霉素及mTOR-siRNA联合雷帕霉素或顺铂对细胞增殖的影响；另外，通过愈伤试验观察细胞伤口的愈合能力，检测雷帕霉素对细胞迁移能力的影响。 2．2 Western Blotting和RT-PCR 提取雷帕霉素或mTOR-siRNA处理的EC9706细胞总蛋白及不同处理方式的裸鼠食管鳞癌细胞移植瘤组织总蛋白及总RNA，Western Blotting分析mTOR、p70S6K、p-p70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1和Akt1／2蛋白表达情况，RT-PCR检测 mTOR、p70S6K和4E-BP1的mRNA表达情况。并对结果进行分析统计。 2．3细胞周期和细胞凋亡 用不同浓度雷帕霉素或用mTOR-siRNA单独或二者联合处理细胞，用流式细胞仪检测处于不同细胞周期的细胞数目及凋亡细胞比例，证实雷帕霉素及 mTOR-siRNA对细胞周期和细胞凋亡的影响；另外，我们用雷帕霉素处理细胞后，提取细胞总DNA，用DNA Ladder试验分析雷帕霉素的促凋亡作用。 2．4体内抑瘤试验 把EC9706细胞或转染过mTOR-siRNA的EC9706细胞注入裸鼠皮下，观察食管鳞癌细胞EC9706的致瘤能力。用雷帕霉素或顺铂对荷瘤裸鼠 治疗两周，测量肿瘤大小，绘制生长曲线，比较治疗前后