实验三、农杆菌感受态细胞制备及转化.pptxVIP

实验三、农杆菌感受态细胞制备及转化 王欢欢 二零一二.十 植物基因工程实验技术 OD值与细菌生长曲线 I.调整期（lag phase） II.对数期( logarithmic phase) III.稳定期（stationary phase） IV.衰亡期（decline phase） 在对数生长期，OD值可以代表菌体密度，细菌悬液浓度与光密度成正比，可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液浓度。但当生长到一定时间后，OD值不会再增加. 农杆菌介导基因转化 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 农杆菌感受态 感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态. 重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分子的状态，即成为感受态细胞。 电击法， CaCl2法。 不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态. 农杆菌感受态的制备 感受态制备的要点： OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化 当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。 分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要摇匀。注意比色杯的正确选择及使用 光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。 玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；若在350毫微米以下，必需使用石英比色杯。 农杆菌的转化 载体分子带有抗生素抗性基因（kan），感受态受体细胞本身不具有抗生素的抗性，没有导入载体的细胞在抗生素培养基上便不能生长。 感受态细胞制备及转化中出现的问题 感受态转化效率关键是菌液OD值的控制。 转化效率的关键是感受态细胞的活性以及外载体分子的质量，质粒/连接产物。 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化效率将会降低。 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所有的试剂都要灭菌 感受态细胞制备及转化中出现的问题 感受态长期保存要进行速冻，立即用-80 ℃冰箱或液氮速冻，而在使用时，用37 ℃水浴或手掌体温进行速融，避免冰晶形成过程对细胞造成的伤害，导致细胞破损不能存活。 感受态细胞不能反复冻融。 涂板后时间过长会有假阳性转化子的出现，抗生素在37℃过夜后失活，抗生素作用是抑制未转化的感受态细胞生长，而不能将这些细胞杀死，所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。