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一抗 购买时 五注意 注意种属(rat mouse rabbit )， 注意特性（单抗、多抗） 注意用途（WT 组化）－－识别的是特异序列 不是特异构象 注意价格（最小包装 国内分装） 注意品牌（Merck Sigma CST Santa） 操作 : 严格无菌防污染 可分装保存 量按0.1ml/cm2 稀释浓度: 经验 文献 点杂交 封口袋摇床上缓慢摇动或 倒扣法孵育 37 ℃ 1h 或 4℃过夜, TBS洗涤5min x 3次 真空抽滤印迹系统 样品量少 大量样品筛查 摸索实验参数 检测抗体质量 点杂交 一抗 1:500 1:500 1:1000 1:1000 二抗 1:1000 1:5000 1:10000 1:20000 曝光时间 30秒 30秒 60秒 60秒 二抗 看种属 （羊抗兔 兔抗鼠） 看用途 （HRP 荧光） 看价格 （国产品牌已能胜任 鼎国 中杉 看品牌 但实验室买进口包装更划算） 操作: 封口袋摇床上缓慢摇动或 倒扣法孵育 37 ℃ 1h TBST洗涤5min x 3次 大分子量蛋白 6%-8% 的胶 用Tris－乙酸 running buffer 延长胶平衡时间 增加转膜时间 提高电压或电流 但要注意温度 transfer buffer 里加入0.1％的SDS 小分子量蛋白 12%-15%的胶 Tris－tricine running buffer 选小孔径的膜 0.2um 缩短时间 降低电压或电流 浸泡膜时间小于10min 半干转 三缓冲液系统 阳极缓冲液Ⅰ： 0.3M Tris ph10.4 阳极缓冲液Ⅱ ：25mM Tris Ph10.4 阴极缓冲液： 25mM Tris ，40mM 氨基己酸 Ph9.4 滤纸 胶 膜 大小要一致 否则容易短路 产热 不能有气泡 玻璃棒轻轻滚动 恒压也可恒流 2.5mA/cm2 恒流 －－电压慢慢升高 结束时是开始的1.5倍到3倍 显色法： 方便 、 经济 有毒 、灵敏度低、 费抗体、反应慢、 不易保存、不能重新剥离检测 DAB显色液 DAB 2-4mg 0.05MpH7.4 Tris HCl 10ml 3％ H2O2 20ul 培养皿中与膜孵育 至出现条带 水冲洗终止反应 检测： 显色法 发光法 发光法 ： 灵敏、快速、节省抗体、反应快 无害、特异性高、 可重新剥离检测 配好发光液 －－将膜沥干－－放入暗盒－－加发光液，孵育1min－－加盖塑料膜－－覆盖X光片－－关闭暗盒曝光 时间根据荧光亮度决定 10 s 15s 30s 1min 3min 10min 10s－1min 1min－5min 30min 晾干 暗室操作 发光完的膜 仍可做DAB染色 strip 掉抗体（50度30min） 漂洗3遍后 从封闭开始，做其他抗体 荧光标记二抗 激光扫描 Western Blot常见问题分析 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转