电泳技术.ppt

电泳的含义带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。电泳的应用1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2. 分析某种物质的纯度及分子量 染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。 定量： 取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4N NaOH 4ml； 剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色洗出，约半小时； 用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。 6. 计算： 光密度总和 T ＝ A+α1+α2+β+γ 白蛋白％＝A/T×100% α1球蛋白％＝ α1/T ×100% α2球蛋白％＝ α2/T ×100% β球蛋白％＝ β/T ×100% γ球蛋白％＝ γ/T ×100% * 一般性实验 -2 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 电泳的基本原理 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。 F＝QE 质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην（r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度） 当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即：QE＝6πrην 在同一电泳条件下，不同的物质因其分子大小（r）和带电量（Q）的差异而具有不同的泳动速度，因此，电泳一定的时间（t）就可互相分离。 E q f qE gh n π 6 = = 待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状。 分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离； 缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。 支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。 缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 ；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。 电泳的影响因素 血清蛋白醋酸纤维膜电泳 实验目的 掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义 熟悉电泳仪器的使用和操作 + 白蛋白(A) α1 α2 β γ 血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。 156000-300000 6.85-7.50 γ 90000-150000 5.12 β α1：20000 α2：30000 5.06 α 69000 4.88 白蛋白 分子量 等电点 蛋白名称 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。 醋酸纤维素薄膜的特性 实验操作及注意事项 膜的预处理：将薄膜切成2.5×8cm，无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，膜条自然浸湿下沉。取充分浸透的膜条，滤纸吸取多余的缓冲液，不要弄太干。 加样：光面用铅笔标注，无光泽面距一端1.5cm处用点样器蘸取新鲜血清点样（不能看见有液滴形成），待血清进入膜内，移开点样器。 电泳：放置于电泳槽架时，无光泽面向下，点样端置于负极，膜与电极紧密接触，不能留有气泡，平衡5分钟，通电1h。