第十二动物细胞的大规模培养技术.docVIP

第十二 动物细胞的大规模培养技术 大规模培养哺乳类细胞是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种有效的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，推动了生物学和医学的发展，给医学卫生事业带来了巨大的社会效益和经济效益。基因工程技术、细胞工程技术，以及新的细胞大规模繁殖培养系统的发展，是构成上述成就的主要原因。然而，体外大规模繁殖真核细胞要比原核细胞困难得多，如细菌、酵母菌和霉菌的细胞壁厚，能耐受搅拌，不易破碎，营养要求低，生长条件易于控制，增殖周期短，产品的产量也高，目前国外已用20万L发酵罐进行生产。而真核细胞膜薄而娇嫩、易碎，对营养要求高，大多数细胞必须贴壁附着生长，更重要的是真核细胞具有原核细胞所没有的功能，能对其分泌产物进行修饰，例如二硫键的形成、糖甲酰化等，使产物具有完整的生物学功能，另外原核细胞经基因工程技术所合成的生物制品，不是分泌型的而是同细胞相结合的，需要破碎细胞，释出产物，再经浓缩、纯化；因后加工过程复杂，而使产品的得率受到损失。利用真核细胞，可以不断合成和分泌，不断收获，后加工过程也相对简单，而且细胞往往可以重复利用。因此，利用培养的动物细胞生产的生物制品，仍有很高的市场价值。 实验室常规培养动物细胞的方法是用人工合成培养液加上一定量的小牛血清，将细胞放在不同的容器中进行培养，如微孔板、培养皿以及各种培养瓶等。一船培养容器的体积很小，最大培养体积为1—2L。用这种方法培养的细胞所分泌的产物是有限的，无法满足实验研究和应用研究的需要。利用小鼠腹水法繁殖杂交瘤细胞生产各种单克隆抗体；虽然能获得较高浓度的单克隆抗体，一般每只小鼠腹水单克隆抗体浓度在10mg／m1左右，但不易控制动物的批间差异和非特异的小鼠免疫球蛋白，以及潜在感染因子的污染。单克隆抗体纯度差，分离纯化难度大，成本不低，又不宜用于人体内的诊断和治疗。因此，不可能作为大规模生产单克隆抗体的主要方法。 应用细胞工程技术，建立大规模细胞培养系统生产各种生物活性物质，是一种比较经济可靠的技术。据不完全统计，全世界现有一万多个实验室，400多家工厂从事生物技术产品的研制。近几年来，已研制了几种具有很大前途的技术。具有代表性的有气升式深层培养系统、微载体培养系统、微囊培养系统、大载体培养系统以及中空纤维培养系统。上述五种培养系统均能生产不同的生物制品，它们具有不同的技术特点，但仍需不断完善。中空纤维培养系统和大载体培养系统较为先进，用途更广，似乎更有发展前途。 一、大规模细胞体外培养系统的基本要 （一）新型培养系统的设备 现有的常规搅拌式发酵罐不能满足现代生物技术在体外大规模培养动物细胞的技术和经济要求，必须加以改造，以达到模拟动物体内细胞高密度的生长环境，扩大体外培养细胞的表面积和增加细胞密度同体内细胞一样生长。无菌操作安全可靠、保温和气体交换系统优良，可靠的泡沫控制和适于大批量的混合装置，能保证pH值之稳定；抗泡沫剂、氧气和温度等监测并使其尽快地达到均一。清洗方法简便快速，监视控制自动化，制造用料合适；方法合理，成本低；体积要小而使用方便，并适于多种产物的使用；便于扩大生产等。根据上述要求，要研制一台理想的细胞培养系统需要多学科的专家，如生物学家、机械学家、电子工程技术专家共同研究、设计，并与生产部门密切合作才能达到要求。 (二)细胞株(系)的选择 微生物污染是大规模细胞培养的主要危险。设备、培养液、支持系统和操作方法的复杂性都会引起微生物污染。其中支原体对动物细胞培养威胁最大。因为它们的感染力很高又不易被检测。因此，细胞在使用前必须经过严格的检测。另外，细胞在体外生长时要保持良好的生长速率和分泌功能。为了保持高产稳产的细胞株(系)，应该定期进行筛选工作；为了防止意外事故发生，应将没有支原体污染的细胞定期进行低温保存。 (三)培养液的选择 培养液选择一般是根据所采用的细胞株(系)而定，在原来的基础上加以改良，达到规模培养细胞的要求。大规模培养细胞的培养液中，血清用量大，质量不易控制，生产成本也高，且使产品的后加工增加了一定的难度。为了减少血清用量，就要逐步驯化细胞，使其适应于低血清或无血清培养液。现有两类适用于某些动物细胞的无血清培养液：一种是用激素或其他大分子加入培养液；另一种是以特殊的营养物质(如小牛淋巴液等)替代合血清的培养液配方。利用这两种培养液培养某种细胞都获得了满意结果。但是，值得注意的是在无血清培养液中更可能出现细胞毒(这与水中的微量元素或有机物污染有关)。因此，在培养液制备时必须采用高纯度的水。培养液一般需经o．22／μm的微孔滤膜过滤消毒，最近美国Millip公司生产一种0．1μm的多层正压过滤器能除去支原体的污染。 (四)细胞生长状况的监测 1．温度控制