常见病原菌采样分离过程.doc

金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）奶样的采集： 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前 LF、左后 LH、 右前 RF、右后 RH编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。 （2）乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 （3）鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 菌种的初步分离 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 （2）泄殖腔拭子 以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 首次分离时，将样品在6.5%NaCl营养肉汤中，45℃，18-24小时预增菌进行选择性培养后，将上述培养物以划线方式接种在肠球菌选择性培养基（叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基，BEA）上，37℃，培养18-24小时，从选择性培养基上挑取灰色，半透明，1-2mm大小的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤37℃培养18小时左右。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在BEA琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 需要注意的是由于BEA琼脂颜色的变化导致假阳性的发生，因此，可以将肠球菌疑似菌株在BEA琼脂上进行二次筛选，提高分离准确率。 大肠杆菌采样分离过程 样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 （2）泄殖腔拭子 以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉大肠杆菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取蓝色的单菌落，用营养肉汤37℃培养18小时左右。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 沙门氏菌采样分离过程 样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 （2）泄殖腔拭子 以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 需要注意的是成年动物沙门氏菌携带率非常低，因此对于沙门氏菌的采集应以弱雏为主要分离对象来提高分离率。 首次分离时，将样品在SC肉汤（亚硒酸盐-半胱氨酸肉汤）中，37℃，18-24小时预增菌进行选择性