4疏水层析范例.pptVIP

* * * 第四章 疏 水 层 析 疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析，从作用机制来看，它属于吸附层析。“疏水作用”一词是Kauzmann于1959年首次在“蛋白质进展”杂志中提出的，随后陆续有学者发表用疏水层析成功分离蛋白质的文献报道；如钙调蛋白、苯丙氨酸裂解酶、凝集素等 疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类 根据被分离组分分子表面的疏水残基与固定相的疏水配基之间结合力差异进行的层析分离方法 疏水层析的概念 一、基本原理 利用被分离组分分子表面的疏水补丁、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开 （一）疏水作用 蛋白质与固定相结合原理 蛋白质表面存在的疏水补丁 蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分子内部的疏水残基暴露至分子表面 疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水残基容易与疏水性固定相结合 洗脱原理 通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐渐洗脱） （二）吸附剂 根据基质的性质不同分为： 1.亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖（Sepharose）,配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成 特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统 2.非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合 特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适用于高压层析（如HPLC等） 二、操作 1.制备层析柱 2.加样与洗脱 3.层析柱再生 1．纯化鸡胗钙调蛋白[2] 2．纯化苯丙氨酸裂解酶 三、应用 *