RNAi技术在结肠癌方面应用的研究进展【DOC精选】.doc

RNAi技术在结肠癌方面应用的研究进展 摘要 结肠癌在我国的发病率与国外发达国家相比较低。但近年由于饮食结构变化发病有增加趋势，在消化道肿瘤中仅次于胃癌。RNAi是由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介导，非编码特异性降解相应序列的小mRNA与封闭性核酸酶调控复合物结合，再与互补目标mRNA配对，阻止相应mRNA表达，从而产生特异的基因沉默。随着RNAi技术的出现和飞速发展，其被应用与结肠癌的发生发展的相关研究和治疗等方面的研究报道逐渐增多，为结肠癌的深入研究提供了新的思路。 关键词：RNAi;结肠癌;基因抑制 引言 在2004年9月《Nature》第一次出版了RNA干扰(RNAi)相关的文章之后，短短6年内，RNAi在生物学领域掀起了一场革命，RNA干扰在结肠癌的应用方面有了长足的进步针对细胞信号转导、细胞凋亡、细胞周期调控分子、端粒酶、细胞因子及其受体基因等不同位点而设计的小干扰RNA对结肠癌细胞均有明显的阻抑。为其在肿瘤研究与治疗领域提供了更为有效的方法。 1.RNAi技术 1.1RNAi现象的发现 1989年,Matzke等[1]首次报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草，可引起转基因表达发生沉默的现象。1990年，Napoli等[2]把已知色素基因置于强启动子后，导入矮脚牵牛花中，试图加深牵牛花的颜色，结果却发现花的颜色全部或部分变白。该现象在当时被称为“共抑制”(co-suppression)，即导入基因后，该基因和牵牛花内源的着色基因都被抑制了。1995年，康奈尔大学的Guo等[3]尝试用反义RNA去阻断线虫的par-1基因表达，结果发现反义RNA的确能阻断目的基因的表达，但作为对照的正义RNA，虽不能与活性RNA结合，也照样能引发抑制。1998年，Fire[4]将双链RNA(dsRNA)——正义链与反义链的混合物注入线虫后，结果出现了比单独注入单链要强得多的沉默，并且导致子一代同源基因的沉默。这种现象被称为“RNA干扰”(即RNAi，RNAinterference)。同时，这也是人们第一次对RNAi技术的应用。随后的研究发现，RNAi现象在多种生物中存在，如线虫、果蝇、斑马鱼、真菌以及植物等，生物体可利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用[5]。 1.2RNAi的分子机制 目前,RNAi的作用机制仍不很清楚,尤其在哺乳动物中与植物有很大的差异。但大数学者认为,短片段的dsRNA也许能引起目的基因的沉默,其主要发生在转录水平、转录后水平以及翻译水平上的沉默RNAｉ是一种双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列的基因表达或使其沉默的过程,即序列特异性的转录后基因沉默。在基因干预机制中涉及到两种重要的酶:①Dicer酶,该酶属于RNApolymeraseⅢ(RNA聚合酶Ⅲ)家族,其作用是将的dsRNA或miRNA切割成长度为21-23nt的siRNA,这些siRNA的3′端均含有2nt的突出悬挂碱基及5端的磷酸集团[6];②Argonaute蛋白,目前研究最多的Argonaute-2蛋白,其作用是和siRNA结合形成RNA诱导复合物(RNA,RISC),促进mRNA降解[7].RNAi是一项强大的阻断真核细胞中特异性表达蛋白的技术,主要通过核酸酶(在果蝇中为Dicer)将双链RNA(dsRNA切割成21-23个核苷酸的siRNA,后者在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,其中反义链与相应蛋白可以识别互补的mRNA,并在核酸内切酶的作用下切割靶mRNA,最后再被核酸外切酶进一步降解,从而干扰基因表达。其过程需要多种蛋白因子(RNA诱导的沉默复合体,RISC)及ATP参与,具有生物学特征[8]。新产生的siRNA可作用于同源的mRNA使其降解,形成新一轮的基因沉默效应,从而产生级联放大效应,显著增强对基因表达的抑制作用[9]。siRNA除了能够导致mRNA降解外,还可以使mRNA相对应的DNA甲基化。这一过程扩大了原有的甲基化,更进一步增强了基因沉默效应[10]。siRNA干涉过程大概可分为起始阶段、效应阶段和扩增放大阶段。起始阶段主要是形成足够多的dsRNA;效应阶段为siRNA与多种蛋白因子结合形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),而RISC靶向降解mRNA;扩增放大阶段即为siRNA循环再利用,以形成瀑布式的基因沉默[11]。 1.3RNAi目前的临床应用 RNAi的作用具有高效率和高特异性的特点，能特异地沉默与疾病有关的内源或外源性基因，使疾病相关蛋白的mRNA发生特异性的降解，降解外源RNA病毒、逆转录病毒基因组，成为一种疾病治疗包括病毒感染、癌症、亨廷氏症及类似遗传病，抗移植免疫、抗寄生虫以及寻找药物靶点等的