DNA重组技术关明.pptx

重组DNA技术DNA recombinant technology什么叫重组DNA 技术在宿主细胞中克隆特定的基因并使其表达，以获得基因表达的产物，也可定向改造细胞或生物个体。相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体宿主基本原理重组DNA技术与医学的关系举例一、重组DNA技术相关概念（一） DNA克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。技术水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆个体克隆（动物或植物）　DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA。目的① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）（二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶I 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶GCCTAGGGATCCCCTAGGGATCC G限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。Bam HⅠ+分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 属 系 株 序命名Hin dⅢHaemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。GGATCCCCTAGGⅡ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGGTCGACCAGCTGGCCTAGGATCC GGTCCAGGACCTG5’ 粘性末端HindⅡBam HⅠ++平端切口粘端切口酶的纯度外切核酸酶 碱性磷酸酶DNA 样品的纯度氯仿、苯酚、EDTADNA 的甲基化程度 使用甲基转移酶缺失的菌株制备质粒酶切反应温度DNA 分子的构型反应缓冲液 酶的星号活性(star activity) 在条件改变时，许多酶的识别位点会改变影响限制性内切核酸酶活性的因素DNA 分子的双酶切用两种不同的限制性内切核酸酶切割同一种DNA 分子，从而产生DNA 分子片段带有两个不同的末端。如果载体也用同样的两种酶酶切，那么就可以把外源DNA酶切片段定向地插入到载体分子。DNA 分子的双酶切首先选择可以兼容两种限制性内切酶的体系如果反应体系相差很大，可在第一种酶切反应后， 电泳回收，再在第二种酶的反应体系进行切割。两种限制性内切酶的体系兼容两种限制性内切酶的体系不兼容（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因组DNA (genomic DNA)PCR 扩增获得目的基因引物设计采用引物设计软件可在引物的5’端添加限制性内切酶位点注：目的DNA 内部不能有该酶的识别序列PCR 参数确定退化温度、Mg2+、反应时间、循环次数产物控制在3kb 以下，可以通过混合DNA 聚合酶来有效实施（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。1. 质粒 (plasmid)特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 当外源DNA 片段在BamHI、SalI或Pst I位点插入，可以用引起抗生素基因的失活来筛选重组体。它有来自E.coli的Lac 操纵子的DNA 片段，编码?-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。IPTG可诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的