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分子生物学实验Experiments of molecular biology 实验九 Western Blot 实验九 Western Blot ．Western 免疫印迹 （Western Blot）: Western 免疫印迹 （Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 一、Western blot 介绍 技术发明者： 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。 western blot 这个名称的由来： 最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来类似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个针对蛋白质，人们分别把这两种技术称为Northern和Western，与这两个技术的发明人的名字没有关系了。 Western blot 原理介绍 Western blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白质样品，转移到固相载体 ，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。 Western blot 转膜：NC膜和PVDF膜 NC（尼龙）膜 PVDF（硝酸纤维素膜）膜 材质特点 干的NC膜易碎 机械强度高 蛋白结合能力 80-110ug/cm2 125-200ug/cm2 是否用甲醇处理 不需要 需要 适用范围 0.45um 一般蛋白 0.2um 小于20KD蛋白 0.1um 小于7KD蛋白 0.45um 一般蛋白 0.2um 小于20KD蛋白 Western Blot 显色的方法主要有以下几种： 1. 放射自显影 2.?底物化学发光ECL 3. 底物荧光ECF 4. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 ? DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride（二氨基联苯胺），是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。其具有简单易用，成本低廉的优点，缺点是灵敏度较低。 Western blot 主要实验流程 ECL X -胶片 一抗孵育 二抗孵育 封闭试剂 SDS电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色检测 2 3 4 5 6 Protein Markers Nitrocellulose PVDF 蛋白提取 1 二、仪器、材料 垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子 垂直电泳仪 金属浴 微量移液器（10uL, 100 uL 1000uL） 凝胶成像系统 6. 半干电转槽 三、试剂准备 1、SDS试剂:见SDS Page实验8。2、TBS缓冲液（10×）：Tris 24.23g；NaCl 80.06g溶于去离子水中，定容至1L。3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、TBS-T缓冲液（1×）：10×TBS缓冲液100mL，ddH2O 900mL，Tween-20 1mL，混合均匀，室温保存。 。5、封闭液:含5% 脱脂奶粉TBS-T缓冲液,脱脂奶粉5g 溶于100ml的TBS-T缓冲液中。6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。7、一抗：Anti-His-Tag Mouse IgG1；二抗：Goat Anti-Mouse IgG-HRP。 四、具体实验流程 1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过5X电泳上样缓冲液直接裂解细胞，然后4℃，13,000g离心2min。取上清液作为样品。 2、电泳：制备电泳凝胶，进行SDS，参见实验八 3、半干式转膜：电泳毕，切除浓缩胶，在分离胶左上切角作标记，将凝胶浸入半干电转液中平衡 1 min。剪取与分离胶大小相同的PVDF膜和 6 张滤纸。PVDF膜先浸入电