N(as)实时荧光定量PCR2.ppt

实时荧光相对定量 多重PCR 在一个PCR管中进行两种或两种以上PCR反应 包括内标基因和目的基因 多色双通道检测 使用多种荧光染料标记产物 同时测量两种荧光染料发射的荧光 TaqMan相对定量方法比较目的基因表达差异 双标准曲线法和2-ΔΔc(t) 法 双标准曲线法 用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线 处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值 通过标准曲线计算目标基因和内标基因的绝对拷贝数 用内标基因对目标基因均一化 均一化之后的目标基因值相比得出处理与未处理的样本中目标基因的表达差异 适用范围 需要很精确的结果计算 扩增效率较低 目标基因与内标基因扩增效率差异较大 2-ΔΔc(t) 法 公式推导 M:目标基因，N：内标基因 XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值) (1) XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值) (2) 均一化 (1)/(2): X0M/X0N=2 C(t)N- C(t)M=2-ΔC(t) 处理2与处理1相比：? (X0M2/X0N2): (X0M/X0N)= 2-ΔC(t)2-ΔC(t)1=2-ΔΔC(t) ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1) 当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比 一般步骤 选定目标基因和内标基因 设计两步法逆转录-PCR反应 分析荧光实验图 目标基因C(t)值（处理，未处理） 内标基因C(t)值（处理，未处理） 计算2-ΔΔc(t) 作图 适用范围 不要求很高的精度（预实验） 当扩增效率较高，并且目标基因和内标基因扩增效率比较一致 不做标准曲线，高通量检测（芯片评估） 反应的建立 设计扩增引物和TaqMan探针（荧光染料） 优化多重PCR反应条件（独立PCR反应验证） RT-qPCR 程序 50oC,30min 95oC,15min 94oC,15sec 60oC,1min plate read go to step 3,39 more times 10oC,forever End 问题与解决 引物与探针 探针需要很靠近引物的3‘端 多色法时，避免不同标记的探针识别同一模板 PCR反应问题 多重反应与单独反应相互验证 扩增效率一致 检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的ΔC(t) 问题与解决 以稀释倍数与ΔC(t)作图，当直线的斜率近似于0时，说明目标基因与内标基因扩增效率一致。 问题与解决 为保证扩增效率一致 扩增子长度 引物设计 模板纯度、复杂度等 反应条件 小结 绝对定量和相对定量 SYBR Green I 标准曲线法 TaqMan Probe 双标准曲线法 2-ΔΔc(t) 法 实时荧光定量PCR在临床和科研上的应用 医疗方面的部分应用 临床检测 疾病的临床早期诊断 疗效的考评 遗传病的诊断 等位基因的检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所导致的疾病的检测 肿瘤的诊断 肿瘤相关基因的表达检测 肿瘤标志物检测 研究方面的应用 药物及医疗相关 新药研发 药物疗效研究 分子生物学方面 研究各种处理对细胞中基因表达变化的影响 比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异 DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究 基因整合拷贝数的研究 研究方面的应用 植物学方面： 转基因植物中基因拷贝数与性状的关系 监测转基因植物中基因拷贝数的变化 转基因植株早期的筛选 监测农作物病虫害抗药性变化 研究新的药物及方法 动物学方面： 动物疫情监测 新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究 转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研究及早期筛选 实时荧光定量PCR实验实例 利用TaqMan技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异（双标准曲线法） 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针 标准品（质粒）构造标准曲线 多重PCR反应 阴性对照 无RNA对照（空白） 无逆转录酶对照（基因组） 标准曲线 * F R R Q F’ R’ R Q *