蛋白质分离纯化及鉴定综合实验.docVIP

蛋白质分离纯化及鉴定综合实验 一、实验内容 将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度； 将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度； 将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。 二、实验过程： 1.蛋白质粗提液制备 溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液 （1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳； 磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L； （2）250mL 2.蛋白质浓度测定 （1）溶液配制 1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中； 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。 （2）0~100ug/mL标准曲线测定： 取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL 蛋白质浓度μg/ml 0 20 40 60 80 100 1mg/mL BSA溶液（μl） 0 40 80 120 160 200 蒸馏水（μl） 2000 1960 1920 1880 1840 1800 总体积（μl） 2000 2000 2000 2000 2000 2000 测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。 以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。 （3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。 3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离 （1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。 （2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。 （3）平衡：用10倍于柱床体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液洗柱，是柱中的离子环境和样品中的一致。 （4）上样：柱床表面液体正好达到凝胶表面，关闭活塞，将蛋白粗提液（留过20uL供电泳用）缓慢加到凝胶表面，注意不能把凝胶冲起来 （5）收集：打开活塞，使样品流下，样品完全进入凝胶后，缓慢加入0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液（注意不能把凝胶冲起来）使样品继续流出，分部收集流出物，第一管收集1mL，以后每管收集200uL，共收集6管。 （6）稀释20倍，测定每个组分的蛋白浓度，可只测定一个OD595值，计算各组分的蛋白浓度。 4.SDS—PAGE 溶液配制： 100ml 30%凝胶储液（arc/bis）：29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于80ml蒸馏水中，定容至100ml，避光保存。（该溶液有神经毒性，避免接触皮肤）； 100mL 1.5M Tris-HCl 三（羟甲基）氨基甲烷，pH8.8：18.15gTris 碱溶于60mL蒸馏水中，用HCl调pH至8.8，定容至100ml蒸馏水中； 100ml 0.5M Tris-HCl（缓冲液）,pH6.8：6gTris 碱溶于60ml蒸馏水中，用HCl调pH值至6.8，定容至100ml蒸馏水中； 10ml上样缓冲液：0.5ml ddH2O（重蒸水，经过两次蒸馏的水） + 2.5ml of 0.5M Tris-HCl, pH6.8 + 2ml 甘油 + 4ml 10% SDS（十二烷基硫酸钠二硫苏糖醇.四甲基乙二胺 3