实验酶联免疫吸附测定.pptVIP

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ） 免疫学教研室 免 疫 荧 光 技 术 课程内容 ELISA的原理 ELISA的分类 间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例 原理：将抗原（抗体）固相化，与酶标记的相应抗体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 方法：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA等 ELISA的原理 1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原或抗体的固相化 3.抗原或抗体的酶标记 直接ELISA 间接ELISA 实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清 待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸 操作步骤 包被：正常小鼠血清（IgG）包被，100μl/孔，4℃过夜 封闭：弃去包被液，加入5%脱脂奶粉封闭（ 200μl/孔），37℃,20min 弃去封闭液，用洗涤缓冲液（PBS/Tween20）洗板3次 加入一抗：加入不同稀释度的兔抗鼠IgG血清（ 100μl/孔），以200×起始，空白对照孔用洗液代替， 37℃,20min 洗板3次 加入酶标二抗：加入HRP-驴抗兔抗体（ 100μl/孔）， 37℃,20min 洗板3次 显色：加入底物,100μl/孔。室温避光显色5-10min; 2MH2SO4终止反应 结果判定 A,B排上样完全相同：复孔 酶催化底物液显色 DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。 结果的判定 肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。各组各人独立观察记录。 测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。 结果的判定 空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅 定量方法：标准曲线 注意事项 对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照） 倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢 需要搞清楚的问题 1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记? 三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。 2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELISA在临床中的广泛应用 * 抗原-抗体反应的基本检测方法 凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。 沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。 补体参与的反应 免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。 用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。 免疫标记技术 用FITC-抗IgM单抗计数B细胞 酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA) 酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) E ELISA的分类 （一）直接法 （二）间