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基因工程技术之载体 第Ⅱ部分 基因工程技术之载体 1. 载体 （Vectors） 2. 基因工程对载体的要求 3. 载体 的种类 第一节 质粒载体 复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点及其相关的调控元件。在质粒中，复制起点是一段特定的DNA片段。长约几百碱基对，其相关的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起始的由质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。因此，质粒复制子可被定义为质粒DNA中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。 二、质粒载体的构建 （2）筛选标志不理想 ColE1 2. 质粒载体必须具备的基本条件 3. 质粒的选择标记及其工作原理： 常用抗菌素的抗性工作原理 ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml） iii）卡那霉素（kanamycin，Kan） iv）链霉素（Streptomycin，Str） v）四环素（Tetracycline，Tet） ② 遗传标记 （2）抗菌素选择原理 4. 人工构建的质粒载体的类型 （2）低拷贝数的质粒载体 （3）失控的质粒载体 （4） 插入失活型质粒载体 （5）正选择的质粒载体 （6） 表达型质粒载体 ① 表达载体的结构 五、经典的大肠杆菌质粒载体 （4）克隆位点 2. ColE1 （4）克隆位点 （5）ColE1的选择缺陷 3. pBR322： （5）pBR322的优点 ③ 高拷贝数 （6）pBR322的缺点 （7）pBR322的改进 ② 改造EcoR I 位点 4. pUC系列 （1）元件来源 pUC18/19 （4）选择标记 ② ?-半乳糖苷酶Xgal显色反应： ③ lacZ的?肽互补 2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15） 3）载体lacZ’与?互补 4）?互补的插入失活 ④ IPTG的诱导作用 IPTG诱导的结果： （5）pUC系列载体的优点 六、其它质粒载体 （1）pGEM-3Z的特点： 3. 穿梭质粒载体 （2）常用的穿梭质粒载体 （3）穿梭载体的优点 七、质粒载体的不稳定性 2. 质粒分配方式 （2）随机分配 3. 分离的不稳定性 4. 结构的不稳定性 5. 影响质粒载体稳定性的主要因素 （2）质粒载体的拷贝数 （3）寄主菌的重组体系 第二节 噬菌体载体 T4 Bacteriophage 二、噬菌体的生活周期 2. 溶原周期： 三、单链噬菌体载体 1. 单链DNA噬菌体的特点 2. M13 噬菌体 M13序列 （4）M13的生活周期 （5）没有包装限制 3. M13载体的构建： （2）加入酶切位点 （3）M13载体系列 ③ 对M13mp2的进一步改进 M13mp18的多克隆位点 4. M13系列载体的优点 5. M13载体的缺点 6. 噬菌粒载体（phagemid vectors） （1）噬菌粒载体的特点 （2）常见的噬菌粒载体 （3）pUC118/pUC119 pUC118/119 ② pUC118/119的复制模式 2）单链滚环噬菌体复制模式 ③ 噬菌粒载体的包装 （4）pBluescript 噬菌粒载体（pBS） ③ 常用的 pBluescript 载体 pBS SK+ pBS KS- （5）PCR产物克隆载体 T 载体 pCR2.1 pCR2.1的MCS pCR2.1-topo pCR1000 Promega 公司的T载体系列 pTarget vector T vector的克隆过程——简便！ 7. 噬菌体展示载体（ Phage display vector） （2）噬菌体展示载体的构建 四、双链噬菌体载体—?载体 ?噬菌体和其DNA 2. ?噬菌体的基因组特点 ? genome(48502bp) 3. ?DNA的复制 模型 （2）滚环复制 4. ?噬菌体载体的构建 （3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型： 选择标记: 2）?-半乳糖苷酶失活型载体： ② 替换型载体（substitution vectors) 1）? EMBL4 2）Charon40 （4）?载体的筛选标记 ?载体克隆策略 5. ?载体的体外包装 （2）体外包装过程 （3）体外包装存在的问题： ③ 体外包装的容量限制： （4）?DNA载体的优点 （5） ?DNA载体的缺点 A： A、? DNA不同于质粒DNA，其本身转化效率较低，要对其进行体外包装成为成熟phage颗粒，以增强转化效率，包装过程较复杂，效率不稳定，且费用较高。包装以后较未包装的重组噬菌体感染率高100-1000倍。 B、用途不如质粒载体广。 6. cosmid载体（粘粒） pHC79 （3）cosmid vector的特点 （4）部分cosmid vector （5）cosmid clon