第章基因工程.pptVIP

同源重组关键步骤 ① 同源联会的两个DNA分子的任意一个DNA出现单链切口； ② 两个单链对接，形成半交叉； ③ 半交叉分支移动(branch migration)产生异源双链DNA； ④ 形成Holliday中间体，Holliday中间体的变构和拆分。 （三）目的基因 1. 化学合成法 将要合成的DNA片段3端的第一个核苷酸固定在固相载体上； 加入第二个核苷酸进行缩合反应； 清洗； 进行循环反应； 每次只能合成≤80 个碱基，超过此范围的就要分段合成。 有自身复制子，在宿主细胞内能自主复制并能使目的DNA片段同步扩增； 具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 有可供选择的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定； 分子量尽量小，以容纳较大的外源DNA。 考贝数要高 表达载体要具备使目的基因表达的完整转录单位 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC） YAC 的主要功能成份 着丝粒：mitosis姊妹染色单体分离之必需。 端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。 pET30b质粒图谱 pET30b多克隆位点 SDS插入序列是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分， 插入序列DNA片段全长为750-1500bp IS的特征：IS两侧有二个分离的反向重复序列(inverted repeats, IR)，约 9-41bp； （不同的插入序列有所不同） IS插入靶位点的两侧产生4-12正向重复序列（derect repeat, DR） 一个转座酶（transposase)编码基因 1964年Robin Holliday提出了链断裂重接模型，也就是Holliday模型。参与细菌DNA同源重组的酶有十大肠杆菌 首先是两个DNA分子有充分的序列相同或相似 1.两条相同序列的DNA分子排列整齐； 2.在重组蛋白RecBCD复合物的作用下，使一条DNA分子的一条链断裂，产生单链切口； Rec BCD复合物含有三种酶的活性：依赖于ATP的核酸外切酶活性； 可被ATP增强的核酸内切酶活性； 需要ATP的解螺旋酶活性。 3.重组蛋白Rec A与此单链形成Rec A－单链DNA复合物，催化单链DNA攻击另一双链DNA；并与其中的一条链交叉，交叉向前分支移动，移动到一定距离后， RecBCD切开另一链， 4.在连接酶的作用下，交换连接远末端，形成Holliday中间体。 如切开的链不是原来的断裂的链，重组体的异源双链区的 两侧来自不同的亲本DNA，称为拼接重组体。 如切开的链是原来的断裂的链，重组体的异源双链区的 两侧来自相同的亲本DNA，称为片段重组体。 到目前为止大肠杆菌的同源重组机制了解的最为清楚。 在重组DNA技术中，常需要一些基本工具酶进行基因操作。例如对目的基因和载体处理时，需利用序列特异的酶类准确的切割，重组时需要连接酶的参与。现将工具酶概括于表14-1中。 基因工程的目的是为了分离获得一些感兴趣的基因或DNA 序列，或是为获得感兴趣的基因表达产物，蛋白质。 在基因工程中载体是尤为重要的，没有合适的载体，外源基因很难进入受体细胞或者是进入也不能进行复制和表达。 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。 氨卞和四环素的抗性基因翻译出抗氨卞和四环素的酶. 当外源基因插入氨卞抗性基因中时，质粒就会由原来的抗氨卞转变成对氨卞敏感，这种重组体导入宿主后，宿主在含有氨卞的培养基上就不能生长，在含四环素培养基上能够生长，在四环素培养基上长出的菌落，说明细菌中含有质粒，但是不能说明重组是成功的，应取少量菌落中的细菌接种在含氨卞的培养基上，能够长出来的菌落是阴性菌落，重组不成功，为空质粒；不能生长的为阳性菌落，表示重组成功，应把四环素培养基上的取样菌落保留备用。 噬菌体分头尾两部，其DNA成线状包装在头部，当其尾部附着在宿主大肠杆菌受体时，DNA 通过尾部进入菌体。 采用突变等手段对野生型噬菌体DNA改造，制成各种作用的噬菌体载体， 插入型载体：利用噬菌体DNA 分子中的几个单一酶切位点，插入外源DNA片段。只能插入20kb以下的外源DNA片段。 置换型载体：只能接受野生型l噬菌体DNA的5%的外源DNA片段，所以大的外源DNA片段就不能利用插入型载体