第三章基因工程载体.ppt

运送外源基因高效转入受体细胞 2、为外源基因提供复制能力或整合能力 3、为外源基因的扩增或表达提供条件 外源DNA插入其中不影响载体的复制且切点是单一的，这样可将多个外源 DNA 片段插入其中。 避免基因的非控制性扩散。 00 * * 1.四环素抗性基因（Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2.氨苄青霉素抗性基因（Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。 3. 氯霉素抗性基因（Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4. 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。 * 灭活一些有害基因，比如与质粒移动有关的基因，或影响质粒复制的负调控基因等。 通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量 只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。 目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。 具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型，直接选择转化后的细胞，提高了选择的敏感性。 注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。 并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。 一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体（图4-11）的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。 ?colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。 ?唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。 可以通过插入失活筛选。 * 产生菌对细菌素有自身免疫性 大肠杆菌所产生的细菌素称为大肠菌素(colicin),它除作用于某些型别的大肠杆菌外,还能作用于亲缘关系相近的志贺菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和巴氏杆菌等。 把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。4.36kb的环状双链DNA，碱基序列已经全部清楚。 许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。 载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。缺失流动基因（mob）。这样，质粒就不会从一个细菌接触转移到 * 加入一个在5端带有10个多克隆位点的基因lacZ’ * Lacz基因编码的半乳糖苷酶是四聚体。 Lacz’基因含有lacz基因的前59个密码子，a序列，编码a肽。 * 有mcs的存在，lacz’基因仍然能编码a肽。如果外源基因插入此mcs区，该基因失活。 * x－gal水解后呈现蓝色 * α-互补（α-complementation） α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 β-半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的 β-半乳糖苷酶。例如， lacZ△M15 基因是缺失了编码 β-半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 （称为 lacZ） ，其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。 2.6kb pGEM 系列与 pUC 系列之间的主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即 T7 启动子和 SP6 启动子，它们为 RNA 聚合酶的附着提供特异性识别位点。由于这两个启动子分别位于 lacZ‘ 基因中多克隆位点区的两侧，若在反应体系中加入纯化的 T7 或 SP6 RNA 聚合酶，便可以将已经克隆的外源基因在