胶体金快速免疫诊断技术讲解.pptVIP

由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。 胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存在0℃以下，否则金粒子发生凝聚。 * 蛋白-金复合体的制备 * 必须了解蛋白与胶体金持久结合的物理及化学进程，仅仅把交联物揉合到一起， 虽然成本低廉且简易，却通常会导致聚集体的形成。 一种好的交联物表现为蛋白吸附于金的表面上，与胶乳不同的是，蛋白是被 动地吸附于交联物表面，因而不会出现共价结合。 * 一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。 金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。 在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 * 蛋白通过以下机制于几秒之 内吸附于金表面 金粒子所带负电荷与蛋 白内氨基酸（如赖氨酸） 所带阳性电荷的最初的 相互吸引 蛋白通过某些氨基酸残 基包括色氨酸与金粒子 表面之间的疏水吸附作用 蛋白中的半胱氨酸的硫基与金粒子间的配价结合 * 金颗粒大小的选择 检测信号是由金颗粒聚集于测试线或控制线而出现的信号。这些粒子必须足 够大到能被看见，粒子的尺寸越大，这 些粒子聚集后就越容易被看见。 随着粒子尺寸的增大，位阻现象又 成了一个问题。 此外，这些粒子的尺寸越大，它们在既定体积溶液中存在的数量越小。 这种可见度的需要与位阻现象之间的矛盾现象表明，对于大多数的免疫检测 应用而言，最适的粒子大小是 40nm。在某些情况下当位阻现象成为较大问题时 （如针对较小的抗原），20nm 的粒子则更为合适；当希望出现更深颜色或当分子表面较低的曲率提高了抗原抗体分子间的交互作用，较大一点的粒子则更为可 取。 应该由实验决定确定多少颗粒大小能带来高灵敏度、浅背景色和高稳定性。 * * 蛋白必须要经过前处理 （1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。 （2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。 （3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的金-蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响金-蛋白复合体的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长金-蛋白复合体寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的金-蛋白复合体。 * * 抗体 Antibody 来源差异: 鼠抗,兔抗和羊抗 种类差异: 单抗,多抗 腹水的处理: 饱和硫酸铵沉淀法 特异性:亲和层析柱 浓度: 浓缩 溶解液:不含盐,例如PB 抗原抗体生物原料 抗原 Antigen 偶联抗原物质: BSA, OVA等 毒品检测来源: 合成抗原 待标记蛋白溶液的制备 ? 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。 * 确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值 ?对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH值能够形成结合最稳定的金-蛋白复合体。在高浓度电解质（如NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些金-蛋白复合体的实际情况并不完全如此，最稳定金-蛋白复合体并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。 这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定变化。 * 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶