内毒素实验凝胶法讲稿.pptVIP

 细菌内毒素检查法 （凝胶法） 苏州大学 卫生与环境技术研究所检测中心 什么是细菌内毒素 细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物,它主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分 。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。 细菌内毒素的的单位为EU。10EU约等于1ng。 细菌内毒素的危害 内毒素是外源性致热原，它可激活 中性粒细胞等，使之释放出一种内源 性热原质，作用于体温调节中枢引起 发热。 细菌内毒素的生物活性 1、致热性。2、致死性毒性。 3、白细胞减少。4、Shwartzman反应。5、降低血压，休克6、激活凝血系统。7、诱导对内毒素的耐受性。8、鲎细胞溶解物的凝集。9、刺激淋巴细胞有丝分裂。10、诱导抗感染的特异性抵抗力。11、肿瘤细胞坏死作用。 细菌内毒素检查法概念 本方法是利用鲎试剂检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法 。 细菌内毒素实验（凝胶法） 实验中需要用到的仪器和器皿： ● 超净工作台 ● 恒温培养箱或者水浴锅 ● 电热鼓风干燥箱 ● 移液器和无热源的移液尖（或者去热源的刻度吸管） ● 试管 细菌内毒素实验（凝胶法） 试剂： a）鲎试剂 b）细菌内毒素工作品 c）细菌内毒素检查用水（内毒素含量低 于0.001EU/ml ） 或者无菌无热源的氯化钠注射用水（内毒素含量低于0.5EU/ml ） 实验步骤： 实验用器具的处理： 内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可能存在的外源性内毒素。玻璃器皿置于电热干燥箱内180℃干烤至少2h或者250℃干烤至少30min。塑料器皿置于30％双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后60℃烘干备用。 细菌内毒素实验（凝胶法） 样品处理方法： a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（37±1） ℃恒温箱中浸泡不少于1h； b）小型配件或实体类器具置无热源玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振荡数次，在（37±1） ℃恒温箱中浸泡不少于1h。 制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求供试液的PH值在6.8~8.0之间。 细菌内毒素实验（凝胶法） 样品处理： 浸提介质体积计算公示： V－－浸提介质体积，单位为（ml）； L－－产品细菌内毒素限值，单位为EU/件； λ－－鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。 细菌内毒素实验（凝胶法） 细菌内毒素实验（凝胶法） 检测方法:  1、 A溶液：每副手套用40ml检查用水浸泡,放置37℃保温至少1小时。 2、复溶细菌内毒素工作品，得到浓度为10EU/ml的工作品溶液1ml。 3、 B溶液：用样品浸提液制备1EU/ml浓度的样品阳性对照液。  4、 C溶液：用检查用水制备1EU/ml浓度的内毒素溶液，作为阳性对照。 5、加样反应，取 8 支0.5EU/ml的鲎试剂，各加0.1ml的细菌内毒素检查用水复溶。然后分别加A、B、C、D溶液0.1ml， 四种溶液各做两个平行管。 6、放到37度水浴或恒温培养箱中反应60分钟，观察结果。 细菌内毒素实验（凝胶法） 结果观察： B、C溶液的反应管必须要阳性，就是轻轻倒转180度过来，鲎试剂安瓿里的反应溶液形成了凝胶体，不滑落。 而D溶液，就是细菌内毒素检查用水那2管，必须要阴性，3个条件都满足，就说明试验结果是可信的。最后看A溶液的反应情况： ● 阳性就说明原套器具每套大于20EU，判定为不合格； ● 阴性就说明合格，小于20EU； ● 1管阳性、1管阴性则要重新复查，复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性则判断合格；否则判断为不合格。 * *