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HIV病毒核酸载量检测方法研究进展 　　HIV病毒载量是机体每毫升血浆中含HIV-RNA[7]的拷贝数。是病毒复制和机体免疫清除机制共同作用结果，直接反应机体血液内游离病毒含量。 　　HIV病毒载量检测主要用于已诊断的HIV感染者或艾滋病人抗病毒治疗疗效观察[5]。此外还应用于HIV疫苗研究、试剂的研发生产等。其次在个体诊断方面还可以弥补HIV抗体检测局限性：窗口期、疾病终末期以及HIV感染孕妇所生18个月内婴儿的个体诊断；自身免疫疾病、血液透析、怀孕、肝病、药物、疫苗等导致的HIV抗体不确定结果样本的个体诊断。本文就HIV病毒载量检测方法做一综述。 　　1 HIV病毒核酸载量检测的常用方法 　　1.1 bDNA法定量检测： 分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术，样本用特定裂解液裂解样本后，经探针杂交与信号放大可迅速得到基因定量结果。有灵敏度高、检测范围大和准确定量等优点。亦可通过离心将HIV RNA从病毒颗粒中释放，再用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合，又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。形成HIVRNA寡核苷酸复合物。再加入化学发光底物孵育后放大信号。通过发光强度来定量。该技术的独特分支DNA（人工合成）信号放大系统，其分支可结合多个酶标记物，将捕获的靶标信号放大以便于检测。此检测技术不涉及核酸扩增。根据固相杂交的原理，采用了放大标记探针，目标物不被扩增，但检测信号被放大，提高了灵敏度。bDNA检测步骤[1]：（1）将患者血清或血浆连同含有特异的合成寡聚核苷酸靶探针的裂解液加入微孔；（2）孵育。可释放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA变性，然后靶探针结合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷却洗板；（4）加信号放大探针 （bDNA）到各孔内；（5）孵育。此步骤使bDNA杂交到靶探针的相应部位；（6）冷却洗板；（7）加标记探针到各孔内；（8）孵育，此步骤使酶标记的探针杂交到bDNA上；（9）冷却洗板；（10）加化学发光底物到各孔中；（11）孵育，酶和底物相互作用，产生化学发光信号。产生的光强与样品病毒RNA或DNA的载量成正比。各样品中病毒核酸的含量由与样品一同处理的标准所制作的标准曲线计算获得。 　　1.2 NASBA检测法：依赖核酸序列的扩增（NASBA）法，由一对特异的引物介导、三种酶催化的以单链RNA为模板的恒温扩增技术，有操作简单、特异性强、灵敏度高、不易被污染等优点[3]。其步骤为： 　　1.2.1 核酸提取：按常规RNA提取方法，亦可根据需要自选。 　　1.2.2 核酸扩增：将纯化RNA加到标准NASBA反应体系，在65℃下作用5min去除RNA二级结构，再在恒温的42℃下开始扩增反应。 　　1.2.3 产物的检测： 　　1.2.3.1 直接检测：是早期方法。反应产物直接在琼脂糖甲醛变性凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察单链RNA片段的长度。 　　1.2.3.2 寡核苷酸检测法：将NASBA和ELISA结合，把与检测信号有关的物质标记在核酸探针上，检测该信号从而间接检测RNA。通过探针捕获将地高辛标记的探针和NASBA产物的复合物吸附到微量反应板，作用于底物显色，分析吸光度检测RNA产物。 　　1.3 RT-PCR检测法： 实时荧光定量PCR扩增（real-time PCR），用荧光基团标记探针，5′端标记荧光基团R，3′端标记淬灭基团Q，在没有PCR扩增时，荧光基团和淬灭基团距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光；而PCR扩增时，引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间，用Taq酶的5′-3′外切酶活性，荧光探针水解，荧光基团被释放出来，由于空间上与淬灭基团分开，则发出荧光[2]。发出的荧光被荧光探头检测到，边扩增，边检测，实现了“实时”检测[4]。最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。因此，获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。该法步骤为[1]：（1）样品制备，抽提和浓缩目标RNA，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，检测PCR的产物使用荧光标记的寡核苷酸探针。（3）RT-PCR反应，病毒RNA利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，再用DNA聚合酶对特定片段进行扩增。（4）检测扩增产物，当病毒载量高时，低循环数即能检测到荧光信号，当病毒载量低时，高循环数时才能检测到荧光。循环数与样品载量成线性关系。利用标准品制作循环数与载量的标准曲线就能对样品载量进行定量。