β地中海贫血基因突变类型采用悬浮点阵技术诊断的临床应用.docVIP

β地中海贫血基因突变类型采用悬浮点阵技术诊断的临床应用 　　摘 要：目的：对应用悬浮点阵技术对β地中海贫血基因突变类型实施临床诊断的价值进行研究。方法： 将我院收治的突变β地中海贫血患者和健康体检正常人资料各74例，分别将其定义为研究组和对照组，采用悬浮点阵技术对两组血液标本进行检测，并对比检测结果。结果：各基因位点相应正常探针/空白对照正常探针3，突变基因位点突变探针/空白对照突变探针3，0.5≤突变基因位点突变探针/正常探针1.5，无突变基因位点探针/正常探针0.5。结论：悬浮点阵技术可以作为临床对β地中海贫血基因突变类型进行检测的常规方法，准确率较高。 　　关键词： 悬浮点阵 β地中海贫血 基因突变类型 诊断 　　目前临床已知人类β地中海贫血突变的种类已经达到170种以上，发生突变的实际类型和频率会随着患者所在地域和人种的不同，产生较大差异，中国大陆人群突变频率较高的类型有十种以上[1-3]。本次研究对突变β地中海贫血患者应用悬浮点阵技术实施临床诊断的价值进行研究。现汇报研究如下。 　　1 资料和方法 　　1.1 一般资料 　　选择2011年7月-2013年7月我院收治的突变β地中海贫血患者和健康体检正常人资料各74例，分别将其定义为研究组和对照组。对照组中男性43例，女性31例；患者年龄19-63岁，平均年龄（34.7±1.5）岁；研究组中男性41例，女性33例；研究对象年龄18-65岁，平均年龄（34.9±1.4）岁。两组患者上述两项自然指标组间无显著差异（P0.05），可以进行比较分析。 　　1.2 方法 　　1.2.1 寡核苷酸探针与微球的共价偶联 　　将微球漩涡混合处理20s后进行充分分散；取5×lO6个微球，在容量为1.5ml的离心管中离心处理1min左右，将上清液去除，加入50μL pH值为4.5的浓度为0.1 mol/L的甲基咪唑溶液，漩涡混合，进行超声波处理；加入氨基化探针1.0nmol，实施漩涡混合；加入2.5μL碳二亚胺溶液后充分混匀，在室温、避光状态下孵育30min左右，重复操作1次；加入1.0mL浓度为0.02%的Tween 20，混匀后，实施离心处理1min左右，弃去上清液；加入1.0mL，浓度为0.1% SDS，充分混匀，离心处理1min左右，弃上清液；用浓度为0.1mol/L的甲基咪唑溶液100μL重悬微球，在2～8℃条件下避光保存，待用。 　　1.2.2 相关DNA的提取 　　采用我院现有的全血DNA提取试剂盒，按照标准方法进行提取操作。 　　1.2.3 PCR的扩增处理 　　95℃条件下预变性处理5min，95℃处理1min左右，62℃处理1min左右，72℃处理2min左右，如此循环操作3次；95℃处理1min左右，60℃处理1min左右，72℃处理2min左右，如此循环操作3次；95℃处理1min左右，58℃处理1min左右，72℃处理2min左右，如此循环操作3次；95℃处理1 min左右，55℃处理1 min左右，72℃处理2min左右，如此循环操作3次；末次循环72℃条件下延伸10min左右。 　　1.2.4 杂交处理 　　包括1.5μL寡核苷酸探针偶联微球，33μL 1.5×TMAC杂交液，l4.5μL 1×TE，2.5μL PCR产物。98℃条件下处理10min左右，55℃条件下处理15min左右，如此循环操作1次，l8000g离心处理2min后，将上清液去除；加入50μL用1×TMAC杂交液稀释的PE标记的链亲合素（浓度为1：500），55℃条件下处理10min左右，18000g离心处理2min后，将上清液去除，加入1×TMAC杂交液50μL，漩涡混合处理使微球重悬。 　　1.3 观察指标 　　对两组研究对象的血液悬浮点阵检查结果进行对比。 　　2 结果 　　各基因位点相应正常探针/空白对照正常探针（N/N）3，突变基因位点突变探针/空白对照突变探针（M/M）3，0.5≤突变基因位点突变探针/正常探针（M/N）≤1.5，无突变基因位点探针/正常探针（M/N）0.5。 　　3 讨论 　　目前，临床上对β地贫突变类型进行检测的最为常用的方法主要为PCR反向点杂交。上世纪90年代末，随着信息技术和“生物芯片”技术的不断发展，一种新的诊断分析技术平台――液态悬浮点阵技术诞生，复杂基因突变的分析可以真正的实现自动化、高通量化[4-5]。液态悬浮点阵检测技术是近年兴起的可应用于临床筛查诊断的一个平台，该技术可以说集中了分子生物学、免疫学、高分子化学、激光检测技术、微流体技术、计算机技术等多项先进科技，可使分子遗传学和免疫学的多指标自动化高通量检测成为现实，又被称为“液态生物芯片”。是基于流式细胞仪技术兴起的一种“生物芯片”临床诊断技