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三七总皂苷对β―淀粉样蛋白42损伤脑微血管内皮细胞ZO―1表达的影响 　　摘要：目的 观察三七总皂苷对β-淀粉样蛋白（Aβ）42损伤脑微血管内皮细胞ZO-1表达的影响，为阿尔茨海默病的对因治疗提供新的依据。方法 细胞分为正常对照组、模型组和三七总皂苷低、中、高剂量组，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，采用MTT比色法检测细胞活力，Western blot检测ZO-1蛋白表达。结果 Aβ42刺激后微血管内皮细胞活力降低（P0.01），ZO-1蛋白表达被抑制（P0.01）；与模型组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组微血管内皮细胞活力增加，其中三七总皂苷中、高剂量组增加较为明显，差异有统计学意义（P0.05），ZO-1蛋白表达增加。结论 三七总皂苷通过抑制Aβ42所致微血管内皮细胞活力降低，恢复血脑屏障的部分屏障功能。 　　关键词：三七总皂苷；阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白42；ZO-1蛋白 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.08.016 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）08-0057-03 　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是发生在中老年人群中的痴呆性疾病，也是最常见的神经退 　　基金项目：国家自然科学基金81202686）；北京中医药大学实验室开放课题（2011-SYSKFKT-01-2） 　　通讯作者：高永红，E-mail：gaoyh7088@ 　　行性疾病之一。AD具有一项特征性的病理变化――老年斑。老年斑的主要成分是β-淀粉样蛋白（β- amyloid，Aβ），Aβ的肽链长短各有不同，沉积于老年斑核心的通常为Aβ1-42/43，并掺杂Aβ1-40。Aβ42较Aβ40更易聚集且神经毒性强，能够迅速集结成淀粉蛋白纤维，可能成为以后Aβ聚集与沉积的开端[1]。研究表明，AD患者脑中可溶性Aβ主要并长期来源于血液[2-4]。血脑屏障能够选择性地允许某些物质由外周血循环入脑，对保持脑内环境稳定有着重要的意义。毛细血管内皮细胞和细胞间紧密连接是血脑屏障的基本结构，而血脑屏障通透性的改变又与紧密连接的主要成分ZO-1分布及缺失密切相关[5]。故在AD发病机制的过程中，研究Aβ在大脑中沉积并导致血脑屏障上主要功能蛋白ZO-1的病理改变具有重要的意义。目前三七已广泛应用于脑血管疾病的治疗中，其主要有效成分三七总皂苷对AD模型动物有着良好的治疗作用[6]。本实验在前期工作的基础上，进一步探讨三七总皂苷对Aβ42损伤脑微血管内皮细胞ZO-1表达的影响，为AD的对因治疗提供新的依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞 　　BalB/c小鼠脑微血管内皮细胞系细胞（中日友好医院娄晋宁教授惠赠），经抗Ⅷ因子抗体、抗CD31抗体及Dil-乙酰化低密度脂蛋白标记摄取检测，符合内皮细胞特性[7]。 　　1.2 主要药物与试剂 　　注射用血塞通（冻干，三七总皂苷，400 mg，哈尔滨珍宝制药，批号。Aβ42（杭州中肽生化有限公司，批号CL-05-00776），胎牛血清（PAA公司），内皮细胞生长因子（中日友好医院临床研究所病理生理室提取），明胶（Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）、MTT（北京索莱宝科技有限公司），硝酸纤维素膜（美国Millipore 公司），BCA蛋白定量测定试剂盒、RIPA裂解液、ECL发光液（北京普利莱基因技术有限公司），蛋白marker（美国MBI公司），Rabbit anti-ZO-1单克隆抗体（美国invitrogen公司）。 　　1.3 主要仪器 　　倒置相差显微镜及成像系统（德国Leica公司，4000B），CO2细胞培养箱（SANYO公司），超净工作台（新加坡ESCO公司）。 　　1.4 细胞培养 　　将细胞接种至已用2%明胶包被的培养瓶中，加入适量内皮细胞培养基（DMEM培养基中添加20%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素100 000 U/L、链霉素100 mg/L、肝素40 000 U/L、内皮细胞生长因子100 mg/L）；37 ℃、5%CO2培养箱培养，2～3 d换液1次，细胞80%融合时传代，实验使用第26代细胞。 　　1.5 β-淀粉样蛋白42孵育 　　将1 mg Aβ42用于HFIP，通风橱干燥挥发后，加入44 μL DMSO溶解，PBS稀释至0.1 mmol/L，过滤除菌，分装，4 ℃放置24 h，-20 ℃冻存备用。用时以DMEM稀释至5 μmoL/L。 　　1.6 分组 　　将单细胞悬液以1×105/mL浓度接种在培养板中，培养48 h，分为正常对照组（A组，DMEM培养基