浅析PCR快速诊断结核性脑膜炎38例.docVIP

浅析PCR快速诊断结核性脑膜炎38例 　　【摘 要】目的：探讨PCR检测技术诊断结核性脑膜炎的临床重要意义。方法：对2006年3月～2011年8月间我院收治的结核性脑膜炎患者随机选取38例进行回顾性的研究。结果：本组研究38例结核性脑膜炎患者，我们分别采用的PCR法、直接涂片染色法、ELISA法进行检测，PCR法阳性率达89.47%，阳性检出率明显高于直接涂片法（阳性率34.21%）和ELISA法（阳性率31.58%），且差异显著（P0.05）。结论：采用PCR法对结核性脑膜炎阳性检出率高，且快速、简便、特异、敏感，对结核性脑膜炎的临床快速诊断及治疗具有重要的意义。 　　【关键词】 PCR法；结核性脑膜炎；阳性率；诊断 　　【文章编号】1004-7484（2014）06-3849-01 　　结核性脑膜炎（TBM）是由结核杆菌引起的脑膜和脊膜的非化脓性炎症性疾病。结核性脑膜炎在肺外结核中最为常见，多起病隐匿，慢性病程。因结核杆菌的基因突变、抗结核药物研制相对滞后和AIDS病患者的增多，国内外结核病的发病率及病死率逐渐增高。【1】因此，如何快速诊断结核性脑膜炎，成为后续及时有效治疗的重要保障。本文采用直接涂片染色法、ELISA法和PCR法对38例结核性脑膜炎患者进行阳性检出率分析，PCR法阳性检出率最高，且快速、简便，具体情况报告如下。 　　1 一般资料与方法 　　1.1 一般资料 　　本组研究中38例患者均随机选自我院2006年3月～2011年8月间收治的已确诊为结核性脑膜炎的病人，其中男性23例，女性15例，年龄在16岁～68岁，平均年龄为33.6±10.5岁。临床上均有轻重不一的发热、头痛、盗汗、食欲减退、全身倦怠无力、精神萎靡不振等症状。分别将38例患者按常规行腰穿刺取CSF，置于-20°C冷冻保存；根据患者的结核分枝杆菌IS986插入序列而设计一对引物，扩增片段为：245bp。 　　1.2方法 　　1.2.1结核杆菌的PCR检测方法 　　首先，提取脑脊液中DNA。取脑脊液100μl，9700g移入试管，用离心机进行离心10分钟，将试管上部清液去掉，用TNE缓冲液将沉淀物处理15分钟，9700g，离心10分钟，去掉上清液，加50μl裂解液，98°C15分钟，9700g，离心5分钟，然后取上清液做成模板；第二步，进行PCR扩增。反应总体积为25μl，10×PCR缓冲液2.5μl，4×dNTP1.5μl，引物1.2各0.25μl，9.5μl无菌去离子水，10μl模板，Taq DNA聚合酶1U/μl，用30μl无菌石蜡油覆盖，进入PCR循环，循环参数为：95°C 持续5分钟，94°C持续1分钟，58°C持续1分钟，72°C持续1分钟，32个循环，最后72°C延伸5分钟；第三步，PCR扩增产物的检测。取15μl扩增产物，以2%琼脂糖（含EB液）上100V电泳30分钟，在紫外光下严密观察结果，如果出现245bp扩增带者确认为阳性，没有观察到245bp扩增带者确认为阴性。 　　1.2.2 直接涂片染色法 　　将CSF经9700g进行离心10分钟，去除上清液，留取沉淀物直接涂片，按常规抗酸染色法染色进行镜检找抗酸杆菌。 　　1.2.3 ELISA检测法 　　将50μl待检CSF加入包被抗原的小孔内，27°C放置10分钟，反应后将之取出，用重蒸水进行冲洗2次，再拍干，每孔加1滴酶应用液，37°C反应10分钟后，用重蒸水进行冲洗5次，拍干，每孔加底物液，室温放置5分钟，观察结果。 　　2 结果 　　本研究我们同时采用的PCR法、直接涂片染色法、ELISA法对38例结核性脑膜炎患者检测分析，其中PCR法检测出阳性34例，阳性率占89.47%；直接涂片染色法检测出13例阳性，阳性率为34.21%；ELISA法检测出12例阳性，阳性率为31.58%。由此可知，PCR法的阳性检出率高于直接涂片法和ELISA法，且差异显著（P0.05），充分说明PCR法检测更有利于临床早期诊断和鉴别诊断，对临床及时确诊及有效治疗具有重要意义。 　　3 讨论 　　近年来，随着科学技术的日新月异，分子生物学诊断技术也得到迅猛发展和广泛应用，使结核菌的实验诊断由常规的表型鉴定转向基因型诊断发展。PCR技术可以获得最准确，可重复性的数据，且耗时比较短。PCR检测法比传统的直接涂片染色法、ELISA检测法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。【2】因此，将PCR技术应用于结核性脑膜炎的快速诊断，更有利于临床诊断和鉴别及治疗，对提高临床疗效具有重要的实践意义。 　　PCR技术属于一种体外基因扩增技术，具特异性。引物具有保守性和与其它菌株同源性等，会直接影响实验检测准确性，因此要合理选择引物。【3】本研究中我们根据患者的结核分枝杆