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定量PCR基本原理及方法 基因有限公司 黄妤 荧光定量PCR基本原理 荧光定量PCR标记方法 荧光定量PCR不同方法学的应用 内容 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ? 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB 荧光定量PCR基本原理 Real-time Chemistries PCR的理论方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数 1. 终点法定量原理 前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同 原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数) 荧光定量PCR的定量原理 阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值。 阈值（threshold）的设定 PCR efficiency =[10(-1/