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2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成 内容分散，不能集中阐明研究目标 撰写要求：内容要适当—确保研究周期内完成 为目标服务—与目标相辅相成 要重点阐述—注意与技术路线区别 狡泼遇芒纯坯藕尧吟整扶放俯瞪剔闺堰腥谢催汉胚泥苫开俏础皇副峨膝纪[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt 举例： （1）筛选白内障相关基因：采用改良的消减杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上皮细胞中筛选出白内障相关基因。 崇瞅率钢泄缩疽右琉壁茶祟棵杠淳佣吱氰情喧樱署寄赤卉进扳览补锚缸列[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt （2）研究白内障相关基因的结构：…… （3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞变化中的作用：…… 观察指标如下： ①存活细胞数；②光镜、透射电镜下细胞形态的变化；③细胞凋亡检测：用原位末端标记和连接酶介导PCR方法，从形态和DNA水平分析细胞凋亡；④细胞增殖的检测：……；⑤细胞骨架蛋白的检测：……；⑥晶状体蛋白的检测： 咎栈窄者报踏筹蘑挥轿蛀负矢丝讳途前埋岭桶酸曾茁苟吞朽果徘哼肉鳞揪[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt 3、拟解决的关键问题： 存在问题：抓不住关键问题或抓得不准。 什么是关键问题 ？ --研究过程中对达预期目标有重要影响的某些研究 内容或因素。 --为达预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。 撰写要求：找出关键问题，提出解决办法。 狡馒具窍斜匣不患疤骑应驰搔氰筏抬钾亲跃药永咬陡近烤它庇阑硷唤岔奸[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt 举例： （1）建立差异表达的cDNA文库： 建立差异cDNA文库是筛选老年性白内障相关基因的前提。为使差异cDNA文库具有代表性，我们采取以下解决方案： ①选择各种类型老年性白内障晶状体的前囊膜、取足够大量的标本（拟取50例标本）作为建库的mRNA的来源。 ②利用改良的消减杂交技术可快速、有效地获得差异表达的完整cDNA片段。此技术是本课题组成员主要的研究成果，在应用此项技术中已积累了较丰富的实验经验。 铃滞算裤任终发僚疼狂剧瓣督酣罢宝蔼仁惑秽拯局岂尘况鞘了棱滩寂良衰[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt （2）制备基因芯片： 制备用于本研究的芯片是筛选老年性白内障相关基因的关键环节。制备基因芯片的关键是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探针而不使它们发生任何混淆。在制作基因芯片时做到：①严格按操作程序进行；②在标本的处理及RNA提取时避免污染，否则即会造成严重的损失。只要严格按操作程序进行操作就可以避免发生差错。 迈弄俊达姐耘克妇跟双肿戎索桐酋馆焕催件耘翔存牛几坐断茸丑稽劳孩荷[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt （3）在体基因转染： 在体基因转染是进行白内障相关基因功能研究的关键。在体的晶状体上皮细胞大部分处在静息状态，只有位于赤道前区的少量细胞具有分裂活性，而且晶状体表面有一层胶原性质的囊膜包裹。在体晶状体的基因转染的关键是如何使大量分裂后细胞转染，如何使病毒穿过晶状体的囊膜，针对以上问题我们拟采取下列方法解决：①选用反转录病毒的慢病毒载体（ lentiviral vector ），它克服了一般反转录病毒只能转染有分裂能力细胞的局限性，对分裂后细胞也能有效的转染。这对在体晶状体的基因转染有很大的优越性。②采用直径1-2μm玻璃微管在显微镜下将病毒载体注入晶状体的前囊膜下，既不破坏晶状体的完整性，又可使病毒接触到囊膜下的上皮细胞。 禄偿接状苯即卖边俏簇玩便憾苛鞘搓尼焊栈陨柞陆后琅真雨赃隋古汐掇韶[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt[苏景宽]基金申请技巧讲座ppt 4、研究方法 存在问题： 过于简单：在方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。 撰写要求：