免疫学实验教学指导书.doc

《 免疫学》实验教学指导书 生物与食品工程学院 2013-05-31 实验一 玻片凝集实验 细菌细胞或红细胞等颗粒性抗原与特异性抗体结合后，在有电解质的情况下，会出现肉眼可以看见的凝集块，称为凝集反应。 这类反应较简单、迅速，常用于抗原或抗体的定性检测。例如细菌的鉴定、分型及ABO血型鉴定。这里介绍人类的ABO血型鉴定方法。 1.原理 ABO血型系统是按照血液中红细胞表面的抗原分子来命名的。人类ABO血型抗原有两种:A抗原和B抗原。A型血红细胞表面有A抗原，B型血红细胞表面有B抗原，AB型血红细胞表面有A、B两种抗原，若红细胞表面无这两种抗原，则为O型血。 若用已知的抗A血清和抗B血清与受试者红细胞上的相应抗原结合，即可能引起红细胞凝集，据凝集状况便可判定出受试者的血型。 2.材料 （1）标准抗A血清、抗B血清。 （2）玻片、75%酒精、碘酒、无菌三棱采血针、灭菌火材棒、无菌棉签。 3.方法 （1）取洁净载玻片1张，用蜡笔分为2格，注明A、B字样。 （2）倒置标准抗血清试剂瓶，悬空轻挤出抗A血清1滴，滴加在A格内；同法在B格内加抗B血清1滴。 （3）消毒左手无名指指尖，待酒精自然干燥后，用无菌采血针快速刺破皮肤。 （4）用木棒的两端取血，分别在抗A血清和抗B血清中搅拌混匀。 （5）无菌干棉球压迫手指止血。 （6）静置玻片数分钟，在白色背景下观察凝集结果。 4.结果判断 混合液由红色均匀浑浊逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者，为红细胞凝集。混合液仍呈均匀浑浊，则未发生凝集。根据结果可判断血型。 5.注意事项 （1）载玻片标明A、B，不要让两种抗血清混合。 （2）采血前要消毒手指，在酒精干燥前不要采血，以免酒精破坏红细胞。 （3）木棒的两端不可混用。 （4）及时观察结果。 （5）对被血液污染的用品在废弃前，要定点放置，集中进行严格的消毒，以防传播疾病。例如，沾血的载玻片浸泡在84消毒液中，木棒、采血针、棉球要高压处理。 6. 作业与思考 （1）按表1上报实验结果。 表1 血型的判断 血型 抗血清 A B AB O 抗A血清 + - + - 抗B血清 - + + - （2）何为凝集实验？ 实验二 试管凝集实验 颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen）（Agglutinin）2.3 0.5 0.5 0.5 0.5 被检血清 0.2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 抗原(1：20) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃1.5 弃0.5 （5）感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中24h，然后观察并记录结果。 （6）结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。 ＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。 ＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。 ＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。 ＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。 －：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。 （7）判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。 4. 作业与思考 （1）详细记录实验报告。 （2）哪些因素影响细菌凝集试验？ 实验三 单向琼脂扩散试验 可溶性抗原(如血清、细菌浸出液、毒素等)和相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，经一定时间，二者在比例适当时形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。参与反应的抗原称为沉淀原，而相应的抗体称为沉淀素。由于沉淀反应的抗原多系胶体溶液，沉淀物主要是由抗体蛋白所组成，为获得抗原与抗体的适宜比例，操作中通常稀释抗原而不稀释抗体，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。 本实验介绍琼脂扩散试验。 1、原理 单向琼脂扩散试验是定量试验，通常是用已知抗体测定未知抗原。试验中将定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，制成含抗体的琼脂板，凝固后打孔。再将待检抗原加入孔内。因抗体与琼脂混合凝固，抗体的浓度