实验五免疫学应用.doc

免疫学应用实验 一、E-玫瑰花环形成实验 掌握人T淋巴细胞形成E-花环的实验原理和操作方法； 熟悉T淋巴细胞的功能检测方法。 二、中性粒细胞吞噬功能测定 掌握中性粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌实验的操作过程；瑞氏染色的基本 步骤及吞噬百分率的计算。 三、抗原抗体反应及免疫学标本片的观察 掌握抗原抗体反应的特异性；熟悉凝集反应的原理、方法和分类。掌握 胶乳凝集试验的原理，熟悉试验方法，了解其应用；熟悉沉淀反应的原理； 熟悉双向琼脂扩散、单向琼脂扩散的操作方法和结果分析。 （1）凝集反应 类风湿因子的检测 （2）沉淀反应 观察琼脂中抗原与抗体反应的单扩和双扩的试验现象 A 单向琼脂扩散试验 操作方法： 制备含抗IgG抗体的琼脂板:溶化的3%琼脂、待冷至56℃时吸取1.5ml琼脂与等量适当稀释的抗IgG抗体混合均匀。倾注于水平放置的塑料板上，制成厚薄 均匀的琼脂板。凝固后用打孔器打孔二排，每排5孔、孔距8—10mm，孔要圆整光滑。 图示 单向琼脂扩散试验模式 加样:用微量加样器加样。 结果分析: 标准曲线的绘制及血清标本中IgG含量的测定。 以各稀释度标准抗原孔沉淀环直径为横座标，相应孔中IgG含量为纵座标在半对数座标纸上作图，画出标准曲线。 依待检血清标本孔沉淀直径，查标准曲线，将查得的唾G含量乘以标本的稀释倍数，即为血清中IgG的含量。 B 双向琼脂扩散试验 操作方法： 将1%生理盐水琼脂加热溶化。 制备琼脂板:取洁净载片一片，放一水平台上，将溶化的2·5m1琼脂趁热用吸管注于玻片上，使其自然流成平面，琼脂凝固后用打孔器打孔，去掉孔中的琼脂。 加样:中央孔中加入甲胎蛋白（AFP）诊断血清，1、4孔加肝癌病人阳性血清，2、3、5、6孔加待检血清。加血清至满勿外溢。不可有气泡。 加样后，将掠脂板放入有一定湿度带盖容器中，置37℃温箱，24小时观察结果。 结果分析: 1、4孔为阳性对照孔(加已知阳性标本)，与中央孔间出现乳白色沉淀线。 其余各孔与中央孔如出现沉淀线，且一端与阳性对照沉淀线相吻合者为阳性。证明该份血清含有甲胎蛋白。如两条沉淀线相交，表明二者抗原性不同，出现的沉淀线另一种抗原抗体反应，不能判定阳性。 如待检孔与中央抗体孔间未出现沉淀线为阴性，证明待检血清中没有甲胎蛋白。 ? ? ? ? ? ? 图示　双向琼脂扩散试验结果 2、6孔：吻合沉淀线（阳性）。 5孔：交叉沉淀线（阴性）。 3孔：无沉淀线（阴性）。 巨噬细胞吞噬功能试验 掌握巨噬细胞的生物学功能；熟悉巨噬细胞吞噬功 能试验的原理和操作方法。 实验原理： 巨噬细胞具有吞噬大颗粒异物的特性，通常选用鸡红细胞作为吞噬颗粒，将其注入小鼠腹腔中，腹腔中巨噬细胞则将鸡红细胞吞入。取小鼠腹腔液涂片、染色后可见鸡红细胞被吞噬的现象，计数100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞的细胞数可判断其吞噬功能。 操作方法： 1、于验前3天，小白鼠腹腔内注射6%可溶性淀粉肉汤1ml。 2、试验当天于每只小鼠腹腔内注射0.5ml 1%鸡红细胞悬液，并轻揉腹部。 3、注射后30min，将小鼠处死、取腹腔液涂片并行瑞氏染色。 4、油镜观察涂片。 实验现象与数据： 镜下可见吞噬细胞细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞胞浆呈红色，而核则染成蓝色（鸡红细胞有细胞核）T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性抗原（PHA、PWM和ConA）刺激均能 使细胞发生转化。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平，常被 作为细胞免疫功能指标之一。淋巴细胞转化试验可从周围血中分离出淋巴细胞， 也可采用全血试验。 操作方法： 1、制备细胞悬液：用培养液将淋巴细胞稀释成2×l06/ml，细胞悬液。 2、分装：向两个小瓶中各加2ml，细胞悬液,一瓶加PHA 0.1ml(100单位)，另瓶不加作对照。 3、37℃培养72小时。离心沉淀，用Hanks液洗两次。 4、用沉淀推成血片,加姬姆萨染液染色,镜下观察计数200个以上淋巴细胞，算出转化率。 实验现象与数据： 1、成热的淋巴细胞:与外周血中小淋巴细胞形态一致、直径6～8微米，核染色质密集、无核仁、胞浆轻度嗜碱性。 2、过度型淋巴细胞:直径10～20微米，核质密，但有明显核仁。 3、淋巴母细胞，细胞增大，形态不规则，直径20～30微米，核也增大，染色质 纤细，核仁1～2个，胞浆扩大，强嗜碱性可见数个空泡及颗粒。 4、网状细胞样母细胞：细胞增大，形态不规则，核