糖尿病患者血浆中游离氨基酸的代谢组学分析及其与血糖值高低的关系.docVIP

血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性研究 韩晓菲a 黄宇虹b 王龙星a 杨乾栩a 肖红斌a * 张德芹b* （a中国科学院大连化学物理研究所 辽宁大连 116023 b天津中医药大学 天津 300193 ） 摘要 本文目的是用代谢组学手段研究血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性 (体积比为45:45:10)，二元线性梯度洗脱，流动相B在30min内由5%-46%，27min内21种氨基酸全部得到良好分离。用此方法测定了51位临床糖尿病人血浆氨基酸代谢谱。以相对峰面积作为原始数据，按血糖值高低预分组，通过spss和matlab软件平台，用线性判别分析、逐步判别分析和得分图进行关联研究，结果表明：血浆中氨基酸代谢谱与血糖值的高低存在相关性，对血糖值＜6.2的志愿者和血糖值＞9.5的志愿者，判别分析的总正判率达到了94.1%。逐步判别分析结果表明，有7种氨基酸Arg、Cit、Asp、Asn、Thr、Leu、Trp承载了上述分组的重要信息，其对上述分组的判别分析总正判率为90.2%，可作为反映血糖值高低变化的标志物组，对于糖尿病的早期诊断及深入研究具有潜在的科研及临床价值）0.5ml，加入冷HClO4 75μL，内标溶液100μL，涡旋混合震荡1min，离心（12000rpm 15min），取上清液600μL，加入等当量的5mol/L 冷NaOH 189μL，二次离心（12000rpm 5min），上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液用于氨基酸的分析。 2.3在线衍生化方法 邻苯二甲醛（OPA）为衍生试剂：量取OPA储备液（ 10mg/ml） 1ml, 加入硼酸盐缓冲液（PH10.2）1ml，再加入3-巯基乙醇（3-MPA）100μL，混匀后，用0.22μm滤膜过滤，待用。衍生化过程在Agilent1200自动进样器上在线自动完成，程序如下：(1)吸取磷酸盐缓冲液(PH10.2) 50μL;（2）吸取样品5.0μL；(3)吸取OPA 衍生试剂 5.0μL;(4)充分混合5次；(5)等待1分钟；（6）进样。 2.4色谱条件 Hypersil C18反相色谱柱，4.6×250mm，粒径 5μm，大连依利特公司生产；流动相A液：10mmol/L Na2HPO4- Na2B4O7 PH7.95缓冲液，B液为乙腈：甲醇：水 (体积比为45:45:10)，柱温为40℃，流速为1.5ml/min，进样量5.0μL，梯度洗脱：流动相B在30min内由5%-46%；紫外检测波长338nm（谱带宽10nm），参考波长390nm（谱带宽10nm）。 3结果与讨论 3.1衍生化试剂 邻苯二甲醛（OPA），常用、低毒，与伯氨基反应，在室温下只需30s即完成反应，适合在线衍生、提高自动化程度及得到高的重复性。但OPA性质不稳定，极易氧化降解而失效 ，经实验验证，每3天需更换一次，为保证高重复性，本实验中采用24小时更换一次，且实验中样品室设为5℃以降低其氧化速率。另外，因OPA只能与伯氨基反应，本实验中氨基酸谱只测定了血浆中丰度较高的伯氨基游离氨基酸，对于仲氨基酸（脯氨酸、羟脯胺酸）及丰度较低的氨基酸在今后研究中会继续研究以丰富氨基酸谱信息。 3.2血浆氨基酸高效液相色谱分析 Pietrzik等认为高半胱氨酸是心血管疾病的标记物，而且还是这种疾病的诱因 [9] ，Bonna等不仅认为高半胱氨酸是心血管疾病的风险因子，而且还证明叶酸、VB12不能降低心梗后心血管疾病再发生[10]。血浆中单个氨基酸与疾病发生密切相关，对氨基酸代谢全谱分析也将成为代谢组学中重要的一部分。氨基酸分子量小，具有两性，有几对氨基酸（Asp/Glu, His/Gly, Arg/Ala, Val/Met）结构性质相近，不宜分离，我们采用经典的邻苯二甲醛为衍生试剂，正缬氨酸为内标物，用柱前衍生化方法建立了血浆中氨基酸代谢谱分析[11]，图1为血浆样品HPLC-UV色谱图，从图中可见在27min内21种氨基酸（包括Gln）得到了很好的基线分离，其中难分离氨基酸对也得到了很好的分离，分离度均在1以上。经优化后最终采用的方法具有仪器普适性强，分析时间短，样品用量少等特点。 3.3方法学考察 对21种氨基酸组成的标准溶液,连续进样5针,峰面积的相对标准偏差RSD为0.54%～3.97%。平行处理5等份同一血浆样本，峰面积的RSD在0.4%～4.3%之间。在加标回收实验中 标准品加入量约为样品氨基酸含量的0.8倍（记为R1）和2倍（记为R2），平均回收率在72.1%～116.0%之间。由于我们所测定的目标小分子为内源性物质，在回收率实验中不能按照传统考察外源性物质的方法考察高、中、低不同浓度水平的加标回收率。在1.6～50μg/ml浓度范围