五聚体重组多肽疫苗的构建及其抗肿瘤活性研究.docVIP

五聚体重组多肽疫苗的构建及其抗肿瘤活性研究 　　虽然分子靶向药物能够清除部分肿瘤细胞,为癌症患者带来益处,但并不能达到终身治愈,这是因为肿瘤诱导的免疫抑制能够促进肿瘤生长、侵袭及远端转移,是限制机体抗肿瘤免疫应答的关键因素。肿瘤免疫抑制机制包括抑制性受体-配体的作用[programmeddeath-1(PD-1)和programmeddeathligand-1(PD-L1)等]、免疫抑制细胞因子[interleukin10(IL-10)和transforminggrowthfactor-beta;(TGF-beta;)等]以及肿瘤免疫抑制细胞[骨髓来源的抑制性细胞(myeloidderivedsuppressorcell,MDSC)、调节性T细胞(regulatoryTcells,Treg)和肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophage,TAM)等]。MDSC是来源于髓系、未成熟的多种细胞群体的统称,包括髓系前体细胞、未成熟的粒细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞等,对T细胞具有强烈的抑制作用。MDSC约占髓系细胞的1%～5%,其中约1/3可在细胞因子的刺激下分化为成熟的髓系细胞,对免疫系统发挥正常功能具有重要的调节作用。但在癌症等疾病中,未成熟的髓系细胞的正常分化途径被扰乱,导致病理状态MDSC的大量产生。MDSC可通过多种机制影响机体固有免疫应答和适应性免疫应答,包括抑制NK细胞的细胞毒活性,抑制树突状细胞(dendriticcell,DC)和巨噬细胞的分化,诱导Treg细胞的产生和扩增等。MDSC还可通过上调精氨酸酶、一氧化氮合酶和活性氧物质的表达来抑制CD8+T淋巴细胞的功能。因此,阻断MDSC的形成,减少由MDSC参与的肿瘤免疫抑制有可能成为增强机体抗肿瘤免疫应答的有效手段。 　　小鼠外周血中的MDSC按照表面标志物可分为两类不同的细胞亚群,一类为CD11b+Ly6G-Ly6Chi,其具有单核细胞的形态,被称为M-MDSC,另一类为CD11b+Ly6G+Ly6CLow的细胞亚群,其具有粒细胞的形态,被称为G-MDSC。而脾脏中主要是单核细胞来源的MDSC。MDSC还带有与其他髓系来源的细胞相同的表面标志物,这些标志物缺乏特异性,因此很难用单一的标志物将MDSC与其他髓系来源的免疫细胞如巨噬细胞和DC等进行区分,这些标志物也不适合作为肿瘤治疗的靶标。2014年,Qin等设计了一个peptibody,可完全清除荷瘤小鼠体内两种亚群的MDSC细胞,他们的研究发现该peptibody可作用于MDSC细胞表面的S100A8蛋白,该研究提示了S100A8可作为MDSC治疗的候选靶点。S100A8属于钙结合蛋白S100蛋白家族,其表达于粒细胞和单核细胞等髓系来源的细胞。在炎症相关的病理条件及胃癌、食道癌等多种癌症中,S100A8均呈现显著的上调表达。最近的研究也表明S100A8在肿瘤部位MDSC的产生和招募过程中扮演着非常重要的角色。在正常情况下,S100A8以及其他S100蛋白家族蛋白为胞内蛋白。但是在炎症和肿瘤的刺激下,MDSC能够将S100A8释放到胞外作为炎症信号。因而S100A8可以作为肿瘤诱导的MDSC细胞表面标志物而用于靶向药物设计。霍乱毒素(choleratoxin,CT)由A亚基(CTA)及一个五聚化的B亚基(CTB)组成,CTB能够与大多数哺乳动物细胞表面的神经节苷脂GM1特异性结合,可促进与其连接抗原蛋白通过黏膜屏障,同时增强抗原被DC等抗原提呈细胞的提呈作用,因此CTB是一个良好的载体蛋白。 　　本文以CTB为载体蛋白构建了一个五聚化的CTB-S100A8多肽疫苗。该疫苗在4T1小鼠乳腺癌肿瘤模型中显示出显著的抗肿瘤保护效果,它产生的抗体能够消除肿瘤诱导的MDSC,同时对机体固有的髓系来源细胞(如DC和巨噬细胞)无显著影响,本研究提示消除MDSC是抗肿瘤的一个有效途径。 　　材料与方法 　　质粒、菌株及试剂大肠杆菌分泌表达载体pCTB2(将CTB基因装载至pSJF2载体形成pCTB2质粒)及表达菌株TG1由江苏省中医药研究院细胞与分子生物学实验室曹鹏博士惠赠;质粒pET28a-S100A8(上海捷瑞生物工程有限公司)。EcoliTG1感受态细胞由本实验室制备及保存,EcoliTop10感受态细胞、EcoliBL21(DE3)感受态细胞及DNA分子量标准(天根生化公司);蛋白分子量标准(Thermo公司)。ClonExpressIIOneStepCloningKit(Vazyme公司);BspEI及BamHI内切酶(NEB公司)。酪蛋白水解物(casinhydrolyate)(Fluka公司);凝胶回收及质粒小提试剂盒(Axygen公司)。流式抗体CD