分析产ＫＰＣ酶肺炎克雷伯菌９株的药敏试验结果.docVIP

分析产ＫＰＣ酶肺炎克雷伯菌９株的药敏试验结果 　　随着碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛使用，对其敏感性降低的肺炎克雷伯菌已经在全球范围内出现，且菌株的种类正在增加，给临床抗感染治疗带来了极大的困难。替加环素(tigecycline)是首个应用于临床的新型甘氨酰环素类抗生素，目前已成为治疗碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染的新选择。本研究检测我院2012年2月-2013年5月分离的9株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌对其他抗菌药物的耐药情况及其产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella　pneumoniae　carbapenemase，KPC)基因，并采用E试验法测定其对替加环素的敏感性，现报道如下。 　　1　材料与方法 　　1.1　材料 　　1.1.1　菌株来源　收集2012年2月-2013年5月分离自我院临床科室的对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌9株，去除同一患者相同部位的重复菌株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603，均购自卫生部临检中心。 　　1.1.2　仪器与试剂　VITEK2　Compact全自动微生物鉴定仪、细菌鉴定卡、药敏卡均为法国生物梅里埃公司产品，5700型聚合酶链反应(PCR)扩增仪购自美国ABI公司，DNA 提取试剂购自上海生工生物工程有限公司，引物合成以及PCR扩增产物测序均由上海生工生物工程有限公司完成。替加环素E试验条购自法国生物梅里埃公司。 　　1.2　方法 　　1.2.1　细菌鉴定及药敏试验　临床标本按《全国临床检验操作规程》第3版规定进行分离接种。所有菌株经VITEK2　Compact全自动微生物鉴定系统及其配套革兰阴性菌鉴定卡进行细菌鉴定。药敏试验采用稀释法，选择的抗菌药物包括氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢西丁、替卡西林-克拉维酸、阿莫西林-克拉维酸、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、氨曲南、哌拉西林-他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南、妥布霉素、甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑。药敏结果判定参照CLSI　2013年版标准进行。替加环素采用E试验条检测抗菌药物对待测菌株的最低抑菌浓度(MIC)，判断标准采用美国FDA推荐的解释标准：敏感，MICle;2.0mg/L;中介，MIC=4.0mg/L;耐药，MICge;8.0mg/L。 　　1.2.2　改良Hodge试验　改良Hodge试验为检测产碳青霉烯酶表型确证试验，参照CLSI　2013年版标准进行。制备直径90　mm、厚4　mm 的Mueller-Hinton(MH)琼脂平皿，采用直接菌落悬液法用生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希菌(ATCC25922)悬液，1∶10稀释后均匀涂布在MH 琼脂平皿上，于平皿中央贴10mu;g/片的厄他培南纸片，将临床分离的肺炎克雷伯菌从纸片边缘向外划直线，35℃培养过夜，抑菌圈内细菌呈矢状生长者为KPC酶阳性。阳性对照为肺炎克雷伯菌ATCC　BAA-1705，阴性对照为肺炎克雷伯菌ATCC　BAA-1706。 　　1.2.3　KPC酶基因检测　质粒DNA提取步骤按照Sangon公司提供的试剂盒说明书进行。根据GenBank公布的KPC酶的DNA序列，利用PrimerPremier　5.0软件自行设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列上游：5prime;-ATG　TCACTG　TAT　CGC　CGT　CT-3prime;，下游：5prime;-TTA　CGTCCC　GTT　GAC　GC-3prime;，产物片段大小为882　bp。PCR 反应体系：ExTaq 酶0.25mu;L，10times;buffer5mu;L，dNTP4mu;L，模板DNA2mu;L，上下游引物各1mu;L，ddH2O36.75mu;L，总体积50mu;L。PCR扩增条件为95℃预变性5　min，94℃变性30　s，56℃退火30　s，68℃延伸45　s，40个循环，最后72℃延伸5　min。PCR阳性产物送上海生工生物有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中比对查询。 　　1.2.4　统计学处理　采用WHONET5.4软件进行数据的检测录入、数据处理与药物敏感性结果的统计学分析。 　　2　结果 　　2.1　9株肺炎克雷伯菌来源分离自痰标本4株、分泌物2株、肺泡灌洗液1株、引流液1株、血液1株;标本来自重症监护病房(ICU)5株、脑系重症科2株、呼吸科1株、骨科1株。 　　2.2　药敏试验结果所分离的9株肺炎克雷伯菌对氨苄西林、头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢西丁、替卡西林-克拉维酸、阿莫西林-克拉维酸、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环