TAT凋亡素融合蛋白探讨.ppt

TAT凋亡素融合蛋白探讨 一、引言 　肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡平衡失调的结果，肿瘤细胞过少的死亡与过多的增殖均可导致肿瘤过快的生长，进而发展成为癌症。因此，诱导细胞凋亡已成为一种有效的肿瘤治疗途径，在癌症治疗方面也有着诱人的发展前景。 　 　　一般说来p53表达产物促进突变的细胞凋 二、可引起细胞凋亡的原因 三、什么是凋亡素 　凋亡素（apoptin）是鸡贫血病毒（chicken anemia virus）基因编码产生的一种功能蛋白（分子量13.6kD），将凋亡素基因导入哺乳类动物细胞，可表达凋亡素并选择性的诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常的二倍体没有毒性和转化活性，也就是说对正常细胞没有任何影响。 四、凋亡素的作用条件 凋亡素只有透过细胞膜进入细胞内，并且进入细胞核与遗传物质相结合才能表现出诱导细胞凋亡的活性，还得有量的积累（但具体积累到多少，浓度达到什么值才起作用目前尚不能确定）。 　　但是细胞膜表面具有多种带负电荷的物质，包括肝素、硫酸乙酰肝素、软骨素硫酸脂等，再加上细胞膜本身的结构特点（磷脂双分子层疏水长链在内亲水磷酸头部在外），阻止像蛋白质这样的极性大分子物质进入，或者是由膜上特殊蛋白介导的具有高度选择性的吸收 五、有关TAT 　TAT即人类免疫缺陷病毒一（HIV-1）反式激活蛋白，属于蛋白转导结构域（PTD）的一种，今年研究发现：它能将与之连接的多肽、蛋白质以及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，转导效率高而对细胞没有损伤，也就是说TAT和其他一些功能蛋白的融合蛋白兼有二者的性质，既能轻易透过生物膜进入细胞又能保持功能蛋白的生物活性。 六、TAT融合蛋白穿膜实例 1、TAT-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性 2、TAT-EDAG融合蛋白的原核表达及其转导活性 　EDAG基因是从人胎肝中分离的具有自主知识产权的新基因，研究表明EDAG（一种功能蛋白）与造血细胞增殖、分化以及凋亡密切相关，EDAG可在体外扩增造血干细胞并维持其未分化状态。 　构建了TAT—EDAG融合蛋白原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中实现了融合蛋白的可溶性原核表达。建立一套稳定的融合蛋白纯化体系，并在体外细胞实验中证明了其转导活性。这为下一步应用于体外造血干细胞扩增奠定了基础。 结论： （1）、TAT-EDAG融合蛋白原核表达载体可以实现构建并能很好地翻译出融合蛋白 （2）、在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中TAT-EDAG融合蛋白原核表达载体实现了融合蛋白的表达 （3）、目前已建立一套稳定的融合蛋白纯 化体系，目的蛋白的纯度达到90％ 以上 　（4）、 TAT-EDAG融合蛋白在体外细胞试验中体现出了较高的转导活性 3、TAT 蛋白转导结构域介导的BCRPABL 融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运 TAT-凋亡素融合蛋白 1、TAT-apoptin表达载体的构建： (1) 借助于质粒载体pET-28a,首先构建pET-28a-TAT载体： 编码链5 端加上Nco工限制酶酶切产生的粘末端CATG，反意链的5端加上BarnH工限制酶酶切产生的粘末端GATC，合成的2条核苷酸链序列如下： 编码链：5 ．CATG GGC TAT GGT CGT AAG AAA CGC CGC CAA CGT CGG CGT G一3 反意链：5 GATC CAC GCC GAC GrIT GGC GGC GrIfr TCT TAC GAC CAT AGC C一3 将合成的2条单核苷酸链磷酸化后等摩尔混合，加热至95摄氏度，缓慢降温退火，形成双链DNA分子，与经Nco工和BarnH工双酶切的载体pET一28a连接，得到的重组载体命名为pET-28a—TAT 2、 pET-28a-TAT-apoptin的表达 将pET-28a-TAT-apoptin重组质粒转化到大肠杆 菌Rosetta(DE3)pLysS中，挑取单菌落接种至含卡那 霉素(50 g／Ill1)的Terrific Broth(TB)培养基中，37 cI= 振荡培养过夜，次日以1：50的比例接种至含卡那霉 素(50．g／m1)的TB培养基中，37℃振荡培养至A鲫 达到0．6时，加入终浓度为0．5 mmol／L IPTG，继续培养6 h，以5 000 dmin离心10 min收集菌体． 3、TAT-凋亡素融合蛋白对肿瘤细胞的作用 DAB显色后，凋亡细胞胞核呈棕褐色着染 TAT-凋亡素融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制 p53的表达产物可以促进突变的细胞凋亡，一般的细胞凋亡是通过诱导p53过表达实现的，而科学研究表明TAT-apoptin