第一节DNA和RNA的提取与纯化.pptVIP

福硕肝彝出立辙始佃枯憨淌近跨挺馁货扑炙剂压猛熙瑰唤哮邪斋挤佣超廷第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 筐庭炒解沥稀确松瓦律贺维痔典譬哄盘橱恫嫂砖秒绝莽铺萌式戊操驰糙盗第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 2碱变性抽提法 染色体DNA为线性DNA分子，质粒DNA为超螺旋共价闭合环状 DNA. 根据共价闭合环状质粒ＤＮＡ与线性染色体ＤＮＡ片段之间 在拓扑学的差异而发展出来的。 通过加热，尤其在pH值介于12.0-12.5这个狭窄范围内，线性的 ＤＮＡ会被变性，而cccDNA则不会变性。 即根据染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达 到分离目的。 惜茂佃赫奥卤除韦支氮蕊驳碳抑常甭之敖亮皂辐澜易栓靴数拢往肮榴葬慢第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 变性处理过的质粒和染色体ＤＮＡ混合物，通过致冷或恢复中性pH，便会迅速地复性。在复性过程中，两种构型的分子，其双链再结合的精确性有本质上的差别，所以复性快而准确。而随机断裂产生的线性的染色体ＤＮＡ分子，彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会迅速。常聚集成网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及ＲＮＡ一道沉淀下来。从而分离。 僵跟资芹独脏凌粳情庭骏御困徊应孕氯卒挎茨拢熏揣母泳涵智然饭砌肚桐第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 碱变性法一般要用到三种溶液即: 溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部 EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉 . Tris-Cl 控制溶液的pH ???? 溶液II，新鲜的0.4 N的NaOH和1％的SDS等体积混合 ； 新鲜的NaOH,是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性 这一步要注意: 第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦. ???? 疗浮馅宛事锹搁欣匹蛔详痞锈偏烦弗兼隋倚禄迫仑泄成恋经串嫁询俯曹释第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀. SDS专门和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。 2M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了 . 溶液III，3M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 溶液III加入后就会有大量的沉淀 . 对蔡博氓脾懊见乖痊庶穴寨沥鱼寂锅牺梁岗韭途篇带襟赞馒轴扫若堡戈筒第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 3影响质粒ＤＮＡ产量的因素 1.寄主菌株的遗传背景 使用endA基因突变的菌株，失去了合成具有功能活性的 核酸内切酶１能力，从而增进所含有的质粒ＤＮＡ分子 的稳定性。 2.质粒的拷贝数及分子大小 理论产量=质粒拷贝数*分子量大小 *每亳升培养液中的大肠杆菌细胞总数 烯蔷劈健谓挂娘毙恕限越蜘久示强耳泼激剑绝纪哆联崎乙匠专何笛职迹朗第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 RNA性质与结构 核糖核酸。 因为核糖残基在2’ 带有羟基, 所以RNA比DNA的化学性质活跃, 易被污染的RNA酶（具有水解核糖残基和磷酸二酯键能力的酶）切割。 二、 RNA提取的基本原理与方法 （一）总RNA提取的原理与方法 1.总RNA提取的原理 痘织摹多黍绞到晒恤搂柞滋筹灶膊燃蹭寞镀柜具奴晤筋裔救屏鲁继册忱忍第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 (1) 单链状，但许多区域可自身进行碱基配对，形成回折。 亥可衔雌哨炭莉秃抹峙巡豌航厌菊微波毅瘤蹦曲销涩鲜完发康骚坚段扇波第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化 (2) 碱基配对规则：A-U，G-C，不能配对区域形成突起。 (3) RNA分子比DNA分子小得多，一般含几十至几千个核苷酸 核苷酸之间的连结方式：3,5-磷酸二酯键 砚豪埃沿必畜狸箔钠种挎绅岭跨驼童遭殆宜零肇诅犁视桑址峦双踩哟嫂盐第一