测定大鼠血浆中士的宁和马钱子碱含量的方法讨论.docVIP

测定大鼠血浆中士的宁和马钱子碱含量的方法讨论 　　通脉丸是全国周围血管专业主任委员崔公让教授的经典处方，由制附子、黄芪、两头尖、制马钱子、丹参等多味中药组成，具有祛风湿、通经络、消肿痛之功效，现为河南中医学院第一附属医院院内制剂，用于治疗血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化闭塞症、风寒湿痹、四肢惊孪等肢体缺血性疾病，临床疗效显著。毒性药材往往是影响临床用药安全的关键，因此研究分析通脉丸中的毒性药材如马钱子的有效成分很有必要，也为通脉丸新制剂的研发奠定基础。马钱子又名番木鳖，始载于《本草纲目· 卷十八》，是马钱科植物马钱Strychnos nux-vomicaLinn 的干燥成熟种子。生物碱为其主要有效成分，其中又以士的宁(strychnine)和马钱子碱(brucine)含量最高，士的宁占总生物碱的35%-50%，其次为马钱子碱。马钱子碱是其镇痛的主要成分，具有很强的镇痛、抗炎、抗肿瘤等药理作用。士的宁临床药理作用较弱，是马钱子的主要毒性成分，炮制后毒性会明显下降。目前的研究显示，小鼠灌服给药，士的宁的LD50 是马钱子碱的71.25 倍，对中枢神经系统和免疫系统及肾脏有毒性作用。目前，已经建立了不同配伍关系中有毒成分或有效成分的化学库，确定了马钱子配伍常用药对洋金花的毒效反应物质基础。本研究建立了UPLC 测定士的宁和马钱子碱血药浓度的分析方法，研究马钱子碱和士的宁在大鼠体内的药动学。 　　1 材料 　　1.1 实验动物 　　SPF 级Wistar 大鼠，280-320 g，雄性，由山东济宁鲁抗动物实验中心提供，许可证号：SCXK饲养环境：室温恒定25℃，湿度为50%，通风状况良好。饲养工作程序：每周两次加水加料、更换垫料、整理卫生、饲养室消毒、垫料笼具等高压灭菌。 　　1.2 实验仪器和试剂 　　H-Class 超高效液相色谱仪(美国Waters 公司);元素型18120 纯水装置(上海摩勒科学仪器有限公司);KQ-100DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Neofuge1600R 台式低温高速离心机(上海力申科学仪器有限公司);PHS-3C 数字式酸度计(上海雷磁仪器厂);GP225D 赛多利斯电子天平(十万分之一天平，德国Sartorius 公司);BSA2245-CW 型电子天平(万分之一天平，德国Sartorius 公司);GM-1.0A 隔膜式真空泵(天津市津腾实验设备有限公司);BT- Ⅱ水浴式氮吹仪(北京八方世纪科技有限公司);IKA- 天才3 涡旋混匀仪(德国IKA 公司);磷酸二氢钾(天津永大，批号;庚烷磺酸钠(山东禹王，批号： 　　2 实验方法 　　2.1 血浆样品处理方法 　　取大鼠全血0.5 mL，15 000 r·min-1 离心8 min，精密吸取上层血浆200 mu;L，加入氨水100 mu;L，涡旋混合30 s，后再加入甲基叔丁基醚1.2 mL，涡旋1 min，15 000 r·min-1 离心15 min 后吸取上层甲基叔丁基醚液，剩余物再次加入甲基叔丁基醚1.2 mL 重复以上操作，合并两次萃取液后于40℃氮气流吹干。残渣加入甲醇溶解，涡旋1 min 后于15 000 r·min-1离心20 min，取上清液测定。 　　2.2 色谱条件 　　Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱(2.1times;100 mm,1.7 mu;m);流动相：乙腈 - 磷酸水(17?83);酸水：0.020 0 mol·L-1 磷酸二氢钾与0.014 8 mol·L-1庚烷磺酸钠等量混合，并用10% 磷酸调体系至pH2.8;流速0.3 mL·min-1;检测波长260 nm;柱温30℃;进样量2 mu;L。 　　2.3 士的宁与马钱子碱对照品溶液的配制 　　精密称取士的宁对照品4.24 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶中，得到84.8 mu;g·mL-1 士的宁对照品溶液，用甲醇稀释至不同的倍数，得到浓度分别为0.068、0.102、0.169、0.424、0.848、1.696、3.392 mu;g·mL-1，7个不同浓度的士的宁对照品溶液。精密称取马钱子碱对照品3.28 mg，加甲醇定容至50 mL 量瓶中，得到65.5 mu;g·mL-1 马钱子碱对照品溶液，用甲醇稀释至不同的倍数，得到浓度分别为0.052、0.079、0.131、0.328、0.656、1.312、2.624mu;g·mL-1，7 个不同浓度的马钱子碱对照品溶液。 　　3 实验结果 　　3.1 方法学考察 　　3.1.1 专属性考察 　　采用上述血浆样品处理方法和UPLC 色谱条件，进样测定