研究孟鲁司特对肠缺血再灌注大鼠的肠黏膜细胞凋亡及相关蛋白表达的影响.docVIP

研究孟鲁司特对肠缺血再灌注大鼠的肠黏膜细胞凋亡及相关蛋白表达的影响 　　肠黏膜上皮稳定的维持，依赖于上皮细胞增殖与凋亡之间的平衡。半胱氨酰白三论文网烯/半胱氨酰白三烯受体 1( cysteinyl leukotrienes/cysteinyl leukotrienes receptor 1，CysLTs / CysLTsR1) 途径与肠缺血再灌注( intestinal ischemia - reperfusion，I /R) 肠黏膜损伤有一定关系。孟鲁司特是特异性CysLTsR1 拮抗剂，跟 CysLTsR1 有高度亲和性和选择性，能有效抑制 CysLTs 与 CysLTsR1 的结合，减轻肠I /R 大鼠肠黏膜损伤[1]。孟鲁司特是否通过抑制肠黏膜细胞凋亡，从而对肠 I/R 起到保护作用尚未见文献报道。为此本实验用肠 I/R 大鼠动物模型，研究孟鲁斯特对 I/R 大鼠肠黏膜细胞凋亡和 CysLTsR1、caspase 8 和 caspase 9 的表达的影响，探讨孟鲁司特对肠 I/R 损伤的保护机制。 　　材料和方法 　　1 材料 　　动物 Wistar 大鼠24 只，雄性，体重( 320 plusmn;300)g，购自中国人民解放论文网军军事医学科学院实验动物中心。合格证号: SCXK -( 军) 2007 -004。药品与试剂 孟鲁司特( 商品名: 顺尔宁) ，规格:每粒4 mg，批号:110705，杭州默沙东制药有限公司生产。末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记测定法( TUNEL) 细胞凋亡原位检测试剂盒，由南京凯基生物科技发展有限公司提供; CysLTsR1、caspase 9和 caspase 8 抗体，购至美国 Abcan 公司。仪器 NC 膜，购自美国 Millipore 公司; TP -214电子天平，丹弗仪器( 北京) 有限公司产品; BH2 显微镜，日本OLYMPUS 公司产品; PS -9 电转仪，大连竞迈科技有限公司产品;MK3 酶标仪，芬兰雷勃公司产品。 　　2 分组与给药 　　随机将24 只大鼠分为 3 组: 假手术组、模型组及实验组，每组均8 只。术前禁食12 h，不论文网禁水。术前1 h，实验组灌胃孟鲁司特2 mg·kg- 1，假手术组和模型组给予等体积0. 9% 氯化钠。 　　3 肠缺血再灌注模型的建立与取样 　　大鼠腹腔内注射10%水合氯醛( 3 mL·kg- 1) 麻醉。仰卧位固定，消毒，上腹部沿正中线切一个长4 ～6 cm 的切口，暴露肠系膜前动脉，距其根部约 0. 5 ～0. 8 cm，游离约 0. 4 ～ 0. 6 cm 肠系膜前动脉。记时 45min 后，松开肠系膜前动脉夹。在进行肠系膜前动脉夹闭期间，间断地向腹腔内注射约 0.9% 氯化钠15 ～ 20 mL·kg- 1。关论文网腹后，再向腹腔内追加 0. 9%氯化钠25 ～30 mL·kg- 1( 含5 万单位青霉素钠) 。术毕放回鼠笼，饲养观察，自由进食、饮水。再灌注90 min 后，处死大鼠。取距离盲肠 10 ～20 cm 处，剪取末端回肠组织，用于检测。 　　4 观察指标和方法 　　4. 1 小肠含水量测定取部分小肠标本，称量小肠湿重，置 90 ℃电热干燥箱内烘烤72 h，称干重。小肠含水量为小肠组织湿重和小肠组织干重的差值与小肠组织湿重的百分比。 　　4. 2 肠黏膜上皮细胞凋亡的检测按照 TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒说明书进行。在显微镜下，观察阳性细胞呈棕褐色。400 倍镜下，在每个组织块选择 3 个阳性视野，计数 200 个细胞中阳性细胞数，作为凋亡指数，任意选择 3 个视野，求其平均值。 　　4. 3 Western blot 检测大鼠肠 CysLTsR1、caspase 8和 caspase 9 的表达 　　将组织剪成细小的碎片，每 20 mg 组织加入裂解液150 ～ 250 mu;L，匀浆至完全裂解。样品于 4 ℃ 、1. 2 times; 104g离心 15 min，取上清，进行蛋白质定量。取所需蛋白，加入适量上样缓冲液，沸水浴10 min 后，离心取上清上样。将配制好的 PAGE 胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液电泳，分离蛋白，当染料到达胶底部时，停止电泳，进行下一步转膜。用5%脱脂奶粉室温封闭1 h 或 4 ℃过夜。根据 CysLTsR1( 1∶500) 、GAPDH( 1∶ 1500) 、Caspase 8( 1∶ 500) 和 caspase 9( 1∶500) 稀释抗体，抗体加入封闭液中，稀释到所需浓度，和膜室温孵育2 h 或4 ℃孵育过夜。按照 1∶1000