流式细胞术(下)技术分析.pptxVIP

流式细胞术之流式细胞仪的应用 韦俊 2013.09 技术专题 目录 染料选择 样本设置 样本制备 数据分析 荧光染料的选择 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 免疫荧光标记 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式（DAPI） 嵌入结合（PI，EB） 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 激光谱线(nm) 备注 DAPI 359 461 UV A –T 特异性 Hoechst33342 346 460 UV A –T 特异性 Hoechst33258 346 460 UV A –T 特异性 PI 536 617 488 不能进入活细胞 EGFP 489 508 488/458 增强绿色荧光蛋白 Ds Red 558 583 568/514/488 红色荧光蛋白 FITC 494 518 488 对pH 敏感 样本的设置 阴性对照：作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，即确定待测标本的基础荧光阈值。 阳性对照：通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。 空白对照：即不进行标记的细胞，用于确定待测标本的基础荧光阈值或检测方法是否成功。 补偿对照：由于荧光光谱的重叠，对于多色分析样本必须设置补偿对照，用于补偿调节。将多色标记的各荧光抗体一一进行单色标记。 荧光补偿调节 补偿前 补偿后 样本的制备 单细胞悬液的制备 目的分子标记 样本过滤等待上机 培养细胞的样品制备 吸除培养上清液，用PBS漂洗一次 将培养细胞用0.04% EDTA-2Na或0.29%胰蛋白酶消化3-7min，至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止，弃去消化液，加PBS液 用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来（尽量避免产生泡沫），并移入离心管中，短时低速离心，即800-1000r/min，5min 弃上清，加pH7.4的PBS液，低速短时离心，800-1000r/min离心3-5min，重复2-3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片 加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀，加固定液或低温保存备用 流式分析样本的制备 单细胞悬液的制备 目的分子标记：最好选用直标抗体，即抗体-荧光素，标记后用PBS洗2-3次。 样本过滤等待上机：标记好的单细胞样本重悬至106个/毫升、300-500微升的总体积，再用300目的滤网过滤至5毫升流式管中等待上机。也可用1-2%的多聚甲醛等固定，24小时内上机测试。 流式分选样本的制备 样本制备的所有过程要在细胞培养间完成 样本制备过程中所需试剂均需做无菌处理：如胰酶、抗体类需用milipore的0.2um滤器过滤，PBS等缓冲液需高压灭菌，所有器械、容器均需高压灭菌等。 样本制备完毕后需用无菌PBS重悬至107——108个/毫升，用400目筛网（经过高压灭菌处理）过滤至5毫升无菌流式管中密封后准备上机。娇气的细胞可加入≤2%的血清保持细胞活性。 样本收集管可采用5毫升无菌流式管、15毫升离心管、6—96孔板等。为了保持细胞活性，收集容器中可加入适量纯血清或完全培养基等备用。 制备好的样本及收集容器密封好后最好放在冰盒上待用。 数据分析 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 设门分析技术 参 数 说 明 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的