动物细胞融合-----鸡血细胞体外融合技术分析.pptx

动物细胞融合-----鸡血细胞体外融合 设计人：赵麒麟 0910150434 黄 华 0910150423 张耀镭 0910150441 邓江岳 0910150436 黄小江 0910150440 2009级临床4班 细胞融合（cell fusion) 两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为自发细胞融合和诱导细胞融合。 细胞杂交（cell hybridzition） 指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。所得到的融合细胞叫杂交细胞。 同核体：由同一亲本细胞融合而来。 异核体：由不同亲本细胞融合而来。 物理法：显微操作、激光诱导、电刺激。 化学法：盐类融合剂、ＰＥＧ法。 生物法：仙台病毒ＨＶＪ法。 诱导融合的方法 病毒诱导细胞融合 　　许多病毒具有凝集动物细胞并促使凝集的动物细胞发生融合的能力，当病毒位于两个细胞之间时，病毒表面的神经氨基酸讲解细胞膜上的蛋白，促使细胞膜局部凝集在细胞周围，在高ｐＨ和钙离子的条件下，局部细胞膜发生融合。 电诱导融合 可以认为是细胞在脉冲电场下，细胞相紧接的区域形成可逆电击穿，即在外加电场下形成的细胞膜电孔，在一定条件下可以自行修复。 PEG诱导融合 PEG是一种多聚化合物，分子（CH2CH2O）nH。PEG靠醚键的联结使其分子末端带有弱电荷，可溶于水。PEG带有大量的负电荷，和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体的粘着和结合，在高Ph高钙离子的条件下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷失调而重新分配，使两种原生质体的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 细胞融合过程 细胞相互靠近 细胞膜的融合 细胞桥的形成 细胞质的融合 细胞核的融合 实验步骤 1.鸡血细胞储备液的制备 取鸡血，加入肝素（100U/5mL全血）制成抗凝全血。再加入4倍体积生理盐水，制成红细胞储备液。 2.鸡血细胞的处理 取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL生理盐水，混匀后，800rpm离心5~6min，弃上清，用5mL生理盐水重悬浮沉淀，重复离心操作1次。 3.鸡血细胞悬液的制备 在离心后的鸡血细胞沉淀中加入适量Hanks缓冲液，将细胞悬浮，镜检，在血细胞计数板上计数。适当的细胞浓度应控制在1×107个/mL左右。根据计数情况调整悬液密度，于37℃保温。 4.PEG诱导细胞融合 吸取1mL鸡血悬液放在离心管中，逐滴加入37℃的50%PEG约0.5mL,边加边轻轻摇动试管，混匀后于37℃水浴静置15min。 5.终止PEG作用 缓慢加入5mL Hanks缓冲液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置10min 制备细胞悬液 6.制备细胞悬液 用吸管轻轻吹打细胞团数次使其分散，离心使细胞沉淀，用Hanks缓冲液重悬浮 7.染色和镜检 吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色3min后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。 操作流程简图 取鸡血加入肝素（100U/5ml） 加入4倍体积的生理盐水储备 取储备液1ml加入4ml生理盐水混匀 800r/min离心5min 弃上清，取5ml生理盐水重离心操作一次 加入hanks液，控制密度在1*10^7个/ml,37度恒温保存 取1ml于离心管加50%PEG约0.5ml(边加边晃动) 37度水浴静置15min 加入5mlhanks液，吹打均匀37度水浴10min 吸管吹打分散，离心沉淀用hanks缓冲液重悬浮 制临时装片，用詹纳斯绿染色3min镜检 镜下观察图像示例 注意事项： 1.温度、融合时间、PEG的浓度与作用时间、细胞密度、机械力等因素均影响融合率，实验操作时应予以注意，并在需要的时候及时镜检。 2.50%的PEG一定得保持在37°C水浴中，防止冷却后结晶析出。 3.离心管必须干燥，防止稀释PEG。