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酶分子定向进化Directed evolution enzyme 酶分子定向进化 酶分子定向进化又称为酶分子体外进化，属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略，是在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。与传统的理性设计相比，它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，产生基因多样性，并结合定向筛选（或选择）技术，获得具有某些预期特征的改构酶。 生物的自然进化 进化过程： 突变→自然选择→遗传后代 进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性) 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物 酶的定向进化 酶分子的合理设计(rational design) 酶分子的定向进化(directed evolution) 体外定向进化的意义 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。 定向进化的原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’-5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的 DNA改组和外显子改组 DNA改组（DNA shuffling）又称有性PCR(sexual PCR)，原理。 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。 外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。 定向进化的选择策略 1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。 高通量的筛选体系 酶的体外定向进化应用实例 分子进化工程的种类 人工获取新基因的方法 常规的基因工程方法 生物功能 蛋白质 基因 新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计 基因的直接进化（directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题 基因直接进化的用途 提改变酶的特性----多功能或单功能酶 高酶活性---天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍 改变底物特异性和对映异构体选择性----酯酶可水解非天然酯类 改变酶的工艺性----冷适应和热适应酶 改善酶的稳定性----二体酶变为单体酶或单体酶变为二体酶 获取许多新的理论知识 TLPs 的失活曲线 TLP-ste突变蛋白的三维结构 酶拓扑结构的变化 蛋白质的耐热机制 天然耐热蛋白质特性： 减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积/体积比；除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去?-支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。 所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至36%，最高不超过7