蛇床子素在大鼠肠缺血再灌注肺损伤模型中的肺保护机制讨论.docVIP

蛇床子素在大鼠肠缺血再灌注肺损伤模型中的肺保护机制讨论 　　前言 　　缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)常发生于创伤、休克、移植、血栓溶栓等临床疾病过程中。对于缺血再灌注损伤，目前尚无理想药物治。 　　蛇床子素是从多种植物如蛇床子、当归中提取的天然香豆素类衍生物。目前广泛应用于皮肤病和妇科病中。动物实验表明，在肝炎模型中，蛇床子素通过介导Caspase-3 信号传导通路抑制肝细胞凋亡，近期研究也发现蛇床子素具有抗炎、抗氧化、治疗急性中风、抗过敏等药理作用。然而，蛇床子素在大鼠肠缺血再灌注肺损伤模型中的肺保护机制方面的抗炎作用，国内尚未见相关研究。本实验旨在通过建立大鼠肠缺血再灌注肺损伤模型，初步探讨蛇床子素对肠缺血再灌注损伤肺组织的保护作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物与用药方法 　　健康成年雄性SD 大鼠，体质量200-250 g，购自第四军医大学实验动物中心，饲养于20-22 ℃室温环境中，自由饮食进水。蛇床子素(西安百灵克公司)，电热恒温干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)，显微镜(德国徕卡公司)，Caspase-3 抗体，辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(美国Sigma 公司)。缺血再灌注后30 min 用药，用药前称量大鼠体重，分别以5 mg/kg、25mg/kg 腹腔注射。 　　1.2 动物模型的建立 　　采用夹闭肠系膜上动脉制造动物模型。腹腔注射1%戊巴比妥40mg/kg 麻醉后，仰卧固定，经口气管插管，并连接呼吸机，腹部备皮消毒后铺巾，无菌条件下取腹正中切口约3-4 cm入腹，找到腹主动脉分支肠系膜上动脉(SMA)并游离，尾静脉注射肝素50U/kg，以无创伤动脉夹夹闭SMA 起始部，缝合切口。I/R 组在缺血60 min 后松开动脉夹，再灌注30min;Ost 组分别以5 mg/kg、25 mg/kg 腹腔注射;假手术组(sham group)单纯游离SMA 而不夹闭。术毕后麻醉处死大鼠获取右肺组织。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 肺组织湿/ 干重比例(W/D)及HE 染色样本肺组织称湿重后80℃电热恒温干燥箱中烤24h 后为干重，计算肺组织湿/ 干重量比值。术后获得的肺组织置于福尔马林中固定、石蜡包埋、切片、染色，光镜下观察肺组织形态学。 　　1.3.2 ELISA 测在4 ℃下灌洗液离心(1000r)5 min 后取上清。依据说明产品说明书进行BCA 蛋白定量。通过ELISA 试剂盒检测白介素1beta;(IL-1beta;)和肿瘤坏死因子alpha;(TNF-alpha;)炎症因子的水平。 　　1.3.3 免疫组化检测常规石蜡切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水后，尿素消化，柠檬酸盐抗原修复，5% 过氧化氢封闭，滴加血清封闭液，加一抗Caspase-3，4℃冰箱孵育过夜复温，滴加生物素标记二抗孵育，亲和素孵育。DAB 显色，中性树胶封片。设置空白对照以PBS 代替一抗，其余步骤同上。 　　1.4 统计学分析 　　实验所得数据均采用SPSS18.0 统计软件进行处理，采用one-way ANOVA 进行统计处理，并用LSD-t 检验进行每两组间比较。以Plt;0.05 为具有统计学意义。 　　2 实验结果 　　2.1 病理组织检查及W/D 比值对照组大鼠肺组织病理表现大致正常;I/R 组肺组织充血、水肿，肺泡结构破坏;Ost 组大鼠用药后，肺组织病理损害明显减轻，均明显优于I/R 组(P lt; 0.05) ，给药组之间亦有显著的统计学差异(P lt; 0.05)，于Ost 25 组表现出最明显的保护效果。 　　2.2 ELISA 检测 　　缺血再灌注肺损伤后，IL-1beta; 和TNF-alpha; 炎症因子的水平明显升高。蛇床子素能显著降低IL-1beta; 和TNF-alpha; 炎症因子的水平表达量。 　　2.3 免疫组化Caspase-3 蛋白的表达 　　I/R 组肺组织Caspase-3 表达较假手术组显著升高，缺血60 min 再灌注30 min 给药之后，各组大鼠Caspase-3 表达与I/R 组比较均显著降低，并且各给药组之间比较，在Ost25 组中Caspase-3 的表达量最低。 　　3 讨论 　　缺血再灌注肺损伤指脏器经历一定时间的缺血后恢复其血流供应，出现缺血性损伤进一步加重的病理现象，其临床表现为肺水肿和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。尽管医疗技术不断发展和改进，但再灌注肺损伤发病率始终很高。因此，如何应对缺血再灌注损伤，针对致病机理做出相应对策越来越受到重视。 　　蛇床子素是我国传统中药，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用。但其在缺血再灌