生化分离工程实验2014修改版研究报告.ppt

将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200 μl于 1.5 ml离心管中，10000 rpm离心1 min，弃上清(可用枪将上清吸尽)。 加入200 μl的无菌水洗涤菌体上残留的培养基， 10000 rpm离心1 min，弃上清，然后重悬于40 μl灭过菌的去离子水中，100 ℃煮沸15 min。 10000 rpm离心1min，取上清5 μl作为菌落PCR的模板。 三、菌液PCR （验证目的基因已转入宿主菌中） PCR体系 H2O 8 μl 10 X PCR buffer 2.5 μl dNTP 2 .0 μl 上游引物(F) 1 μl 下游引物(R) 1 μl Taq酶 0.5 μl 模板 5 μl 总体积 20 μl PCR程序 95 ℃ 5 min 95 ℃ 35 s 55 ℃ 30 s 72 ℃ 40s/90 s 72 ℃ 10 min 25 ℃ 5 min Cycle 30 注：阳性对照(将模板换成1 μl质粒)； 阴性对照（将模板换成5 μl H2O）； 不用重复，PCR管上做好标记！ 琼脂糖凝胶电泳 1. 制备0.8%琼脂糖凝胶(已配好)。 2. 胶板制备:将干净的胶板放入胶槽中，并在固定位置放好梳子。 再将配好的琼脂糖凝胶在微波炉里充分融化，冷却 到65℃左右后小心地倒入胶槽内。室温静置直至凝 胶完全凝固，垂直轻拔梳子。将胶板放入电泳槽中， 添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止。 3. 加样:将PCR后的样品和与Loading Buffer 充分混匀后加入胶 孔 中。每加完一个样品，应更换一个枪头，以防污染。 4.电泳:打开电源进行电泳（电压80V）。约30min后，停止电泳。 5.电泳完毕后，取出凝胶用溴化乙锭（EB）染色。 6.观察照相:在紫外灯下观察并用拍照保存。 将加入诱导剂后的菌液再放入37 ℃，200 rpm的摇床中诱导培养4-5 h后收集菌体。 基因 katB fabZ 沉淀 （离心管对应配平） 8000rpm 离心5min 8000rpm 离心5min 收菌 弃上清，沉淀用 15 ml binding buffer重悬 弃上清，沉淀用 15 ml column buffer重悬 保存 —20℃ —20℃ 注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1ml于1.5ml的离心管中，做好标记（组 号，基因名）记作“诱导后” 放在第八组的离心管板上。 离心时用天平严格配平（差异在0.02 g之内)！ 四、收菌 五、裂解细胞 将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎至菌液成澄清（ 200-300w超声6×10s-10s，约20min）,天平严格配平后10000*g， 4℃，离心20min。上清取1ml于1.5ml离心管中，作标记为“上清”沉淀用1ml对应的buffer（his-tag为binding buffer，pMAL为column buffer）重悬后，保存在1.5ml的离心管中，标记为“沉淀”。 系统 His-Tag系统 pMAL系统 柱子类型 Ni-NTA柱 直链淀粉柱 充电（装满NISO4，温和摇动后自然沉降） 操作方法 3次binding buffer平衡 3次column buffer平衡 堵住下端后上样（10ml）静止5min，盛接流出液后再上样，重复两次 上样（10ml）静止5min，盛接流出液后再上样，重复两次 收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml离心管中，标记“穿透” 收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml离心管中，标记“穿透” wash buffer水洗，直到用100% TCA 检测没有白色沉淀为止，一般4~5次 3次Column buffer水洗，直到用100%TCA 检测没有白色沉淀为止 Elution buffer洗涤（每加1ml用1.5ml离心管收集)共收集7管 Column buffer+10mM麦芽糖的溶液洗涤（每加1ml用1.5ml离心管收集)共收集7管 六、蛋白纯化 生化分离工程实验 指导老师：郝