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讨论益气除痰方对肺癌A549移植瘤细胞的凋亡途径 　　世界卫生组织已在2014年公布癌症成为人类最大的致死原因,而肺癌是当前世界大中城市发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌现有的治疗手段包括手术、放化疗和分子靶向治疗,疗效仍不尽人意,患者生存期无突破。临床研究表明中西医结合治疗可明显提高肺癌患者的生存率,延长生存期。益气除痰方是国家级重点专科广州中医药大学附一院肿瘤科常用的治疗脾虚痰湿型肺癌的基本方,经过长期临床实践,其在中晚期肺癌的治疗中显现优势。本实验研究益气除痰方对肺癌移植瘤组织中Caspase-4、DNA-PK 蛋白表达的影响,从内质网UPR介导细胞凋亡途径探讨其抗癌机制。 　　1 材料与仪器 　　1.1 实验动物 　　BALB/c裸小鼠40只,雌雄各半,体质量16~18g,鼠龄4~5周,IVC级,购于重庆医科大学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(渝) 2012-0002。 　　1.2 细胞株 　　人肺腺癌细胞株A549,由第三军医科大学大坪医院肿瘤实验室赠予。 　　1.3 药物与试剂 　　益气除痰方由党参、白术、茯苓、生半夏、山慈菇、蟾酥等组成。药材购自广州中医药大学第一临床学院,经重庆医科大学中医药学院林於教授鉴定均为正品。中药水煎制成终浓度为含生药2.0g/mL,4℃保存;顺铂注射液为齐鲁制药(海南)有限公司产品,批号:1640培养基、胎牛血清、胰酶为HyClone公司产品,批号分别为:NYK1006、NVM0344、J130049;Caspase-4、DNAPK抗体为北京博奥森生物技术有公司产品,批号分别为bs-0082R、bs-2092R;SP免疫组化试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品,批号为CW2053;Westernblot法二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司的产品山羊抗兔IgG,批号为ZB-2301;发光试剂为MILLIPORE 公司产品,批号为WBKLS0100。 　　1.4 主要仪器 　　电泳仪为Blo-RAO POWER/PAC1000;凝胶成象系统为Blo-RAO GelDoc2000;核酸蛋白分析仪为BECKMANDU640。 　　2 方法 　　2.1 细胞培养与动物造模 　　人肺腺癌细胞株A549细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基中,置于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下的培养箱内培养至对数生长期,用0.25%胰酶消化,制备细胞悬液。40只BALB/c小鼠背侧皮下各接种1times;107 个肺癌A549细胞。 　　2.2 分组与给药 　　当皮下肿瘤生长至可明显扪及时(接种第7天),将小鼠随机分为模型组(生理盐水0.2mL)、顺铂注射液组(0.002g/kg)、益气除痰方低与高剂量组(3.0、6.0g/kg)、益气除痰方(3.0g/kg)+顺铂注射液(0.002g/kg)组,每组8只,中药灌胃,每只0.2mL,1次/d,连用21d。顺铂注射液腹腔注射,每只0.2mL,1次/d,连用7d。 　　2.3 检测指标与方法 　　2.3.1 肿瘤生长抑制率:干预第22天,1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,取出小鼠背侧皮下的肺癌包块,称取瘤质量,计算肿瘤生长抑制率。生长抑制率(%)=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量times;100%。用游标卡尺测量小鼠肿瘤的最长径和最短径,计算肿瘤体积。肿瘤体积=0.52times;长times;宽2。各组肿瘤组织部分以10%多聚甲醛溶液保存,部分置于冻存管中超低温冰箱保存。 CXoNp 　　2.3.2 免疫组织化学法检测各组肿瘤Caspase-4、DNA-PK 的表达:将固定的肿瘤组织脱水包埋并切片,Caspase-4、DNA-PK抗体为一抗,按照试剂盒说明书进行SP 法免疫组化染色。Caspase-4、DNAPK表达的定量分析:选取阳性细胞密集区域,在400倍显微镜下选取20个阳性细胞,用图像分析软件Image-ProPlus6.0.0.260测定平均光密度值。 　　2.3.3 Westernblot检测各组肿瘤Caspase-4、DNA-PK的表达:取冷冻保存的组织,常规匀浆、离心制备组织蛋白提取液,Caspase-4、DNA-PK 抗体为一抗,按照Westernblot 方法检测各组肿瘤Caspase-4、DNA-PK 的表达。Caspase-4、DNA-PK表达的定量分析:运用Westernblot结果分析软件QuantityOne4.6.2分析蛋白含量。 　　2.4 统计学处理 采用统计软件SPSS19.0进行数据分析,实验数据以