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谈Box-Behnken 响应面法优化马钱子提取工艺 　　马钱子又称番木鳖，为马钱科植物马钱Strychnosnux-vomica L. 的干燥成熟种子。本品味苦，性温，有大毒，归肝、脾经，具有通络止痛、散结消肿功效，临床上主要用于跌打损伤、骨折肿痛、风湿顽痹、麻木瘫痪、痈疽疮毒、咽喉肿痛。现代药理研究表面马钱子对中枢系统，心血管系统，免疫系统均有较强的药理作用。其主要有效成分为总生物碱，士的宁( 番木鳖碱) 和马钱子碱占总生物碱的70% ～ 80%。 　　Box-Behnken 响应面法( response surface methodology，RSM) 是统计设计实验技术的合成，利用Box-Behnken 的实验设计并通过实验得到一系列数据，采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。与以往推广的正交设计法相比，RSM 统计设计可以评价指标和因素间的非线性关系，使用方便，条件预测性好，已广泛用于化学合成过程、药物处方筛选和剂型制备过程等的优化。前期文献调研发现，马钱子提取工艺优化主要以单因素考察，正交设计为主，未发现Box-Behnken设计用于马钱子研究。本实验采用Box-Behnken 响应面法对乙醇回流提取工艺中影响马钱子提取的关键因素进行优化，确定操作工艺可行的提取工艺，为后期马钱子制剂的开发奠定基础。 　　1 仪器与试药 　　Agilent 1200 Series 高效液相色谱仪( 美国安捷伦公司) ; KQ5200B 型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) ; YF-103 高速中药粉碎机( 瑞安市永历制药机械有限公司) ; TGL-16G 台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) ; BS124S 电子天平( 德国赛多利斯科学仪器北京有限公司) ; ZNHW 型电热套( 巩义市予华仪器有限公司) ; PH-3C pH 计( 上海仪电科学仪器股份有限公司) ; HH-4 数显恒温水浴锅( 国华电器有限公司) ; SZ-93 自动双重纯水蒸馏器( 上海亚荣生化仪器厂) 。马钱子碱对照品( 纯度gt; 98%，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心， 批号M0 ; 士的宁对照品( 纯度gt; 98%，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号S0 。磷酸二氢钾( 国药集团化学试剂有限公司) ; 庚烷磺酸钠( 上海蓝季科技发展有限公司) ; 盐酸( 西陇化工股份有限公司) ; 乙醇( 纯度为95%，天津市大茂化学试剂厂) ; 甲醇( 美国天地公司) ; 乙腈( 美国天地公司) 。沙烫马钱子饮片购于南昌市开心人大药房，经江西中医药大学中药鉴定学教研室龚千峰教授鉴定为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L. 的干燥成熟种子。 　　2 方法与结果 　　2. 1 马钱子碱、士的宁测定方法的建立 　　2. 1. 1 色谱条件采用phenomenex C18色谱柱( 4. 6 mm times; 250 mm，5 mu;m) ; 以乙腈-0. 01 mol /L 庚烷磺酸钠与0. 02 mol /L 磷酸二氢钾等量混合溶液( 用10%磷酸调节pH 为2. 8) ( 21 ∶ 79) 为流动相;检测波长为260 nm; 柱温为35 ℃。在此条件下，2 个生物碱类成分分离度良好。品溶液稳定性良好。 　　2. 1. 2 加样回收率试验取成分含有量已知的马钱子提取液1 mL 于10 mL 量瓶中，分别加入相当于马钱子提取液中马钱子碱、士的宁含有量0. 8倍、1. 0 倍、1. 2 倍的马钱子碱、士的宁对照品，加甲醇定容，摇匀。每个剂量组平行制备3 份进样测定，并计算各成分的平均加样回收率及RSD 值。结果马钱子平均加样回收率为100. 35%，RSD 为0. 8%; 士的宁平均加样回收率为99. 57%，RSD 为1. 2% ( n = 9) ，表明该方法准确度良好。 　　2. 2 马钱子提取工艺的优化 　　2. 2. 1 单因素试验 　　2. 2. 1. 1 液料比考察取马钱子粉末，每份15 g，分别加50% 乙醇6、8、10、12、14 倍，溶液用10%磷酸调pH 为5. 0，煎煮1 h。随着溶剂量的增加马钱子综合效应值先升高后下降，当溶剂量增加到12 倍时综合效应值达到最大，因此最佳料液比为加入12 倍量的溶剂。 　　2. 2. 1. 2 提取时间考察取马钱子粉末，每份15 g，加10 倍量50%乙醇溶液，用10%磷酸调pH为5. 0，不同煎煮时间( 0. 5、1、1. 5、2 及2. 5h) 条件下提取马钱子碱和士的宁。随着提取时间的增加马钱子综合效应