谈固相微萃取-高效液相色谱联用测定马钱子中士的宁、马钱子碱含量.docVIP

谈固相微萃取-高效液相色谱联用测定马钱子中士的宁、马钱子碱含量 　　马钱子为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica Linn 的干燥成熟种子，具有通络止痛，散结消肿的功效，常用于跌打损伤，骨折肿痛，风湿顽痹，麻木瘫痪，痈疽疮毒，咽喉肿痛等症状。研究发现，马钱子中有效成分主要为生物碱类，其含量约为生药的1. 5% ～ 5%，而其中含量占生物碱45% 的为士的宁，马钱子碱次之。这两种生物碱不仅是主要的活性成分，同时也是主要的毒性成分。其中士的宁的毒性最强，并且其治疗量和中毒量十分接近。据报道，成人一次服用5 ～10 mg 士的宁可引起中毒，30 mg 可致死亡，口服5 mg 可致幼儿死亡;而马钱子碱安全范围较士的宁稍大。因此建立一种可以高效、准确测定马钱子中士的宁和马钱子碱含量的方法，不仅便于通过测定药材中两种生物碱含量来控制马钱子的质量，而且可用于指导临床安全用药，减少不良反应。固相微萃取技术(solid-phase microextraction，SPME ) 是一种新颖的样品前处理与富集技术，和传统的萃取技术相比，具有操作简便、污染小、快速、经济等优点。现已广泛的应用在医药、食品、环境、商检、化工等领域。本文自制固相微萃取毛细管整体柱对药材进行萃取，并与高效液相色谱相结合，建立了准确、高效的可用于测定马钱子中主要活性成分的新方法，现报道如下。 　　1 仪器与试药 　　1. 1 仪器 　　岛津LC-20AT 高效液相色谱仪:包括岛津20A二元色谱泵、20A 紫外检测器和柱恒温箱、岛津LC Solution 化学工作站;注射器泵(美国KDs，MA);AUY120 电子天平( 日本岛津公司);SB-5200D 超声波清洗器机( 宁波新芝生物科技股份有限公司);101-0AB 电热鼓风恒温干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。 　　1. 2 试药 　　士的宁对照品、马钱子碱对照品购自中国食品药品检定研究院，批号分别为0705-200306、0706-200505( 供含量测定用);马钱子购自安徽新兴中药材饮片有限公司，批号:101011，广西产，经该公司质检科的主管药师李威鉴定为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica. L. 的干燥成熟种子。毛细管购自河北省永年锐沣色谱器件有限公司;甲基丙烯酰氧基甲基三乙氧基硅烷，聚丙烯酰胺(AA)、4- 乙烯基吡啶(4-VP)、N，N -亚甲基双丙烯酰胺(bis) 购自天津化学试剂有限公司;氮二异丁腈(AIBN)、月桂醇购自上海试一化学试剂有限公司;甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 　　2 方法与结果 　　2. 1 色谱条件 　　色谱柱:Hypersil ODS 柱(150 mm times; 4. 6 mm，5 mu;m);流动相:乙腈-0. 01 mol·L-1 庚烷磺酸钠与0. 02 mol·L-1 磷酸二氢钾等量混合溶液(用10% 磷酸调节pH至2. 8)(21 ∶79);检测波长:260 nm;进样量:20 mu;l;柱温:25℃。 　　2. 2 对照品溶液配制 　　精密称取士的宁对照品约6 mg 和马钱子对照品约5mg，分别置于10 ml 量瓶中，加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。分别各精密量取2 ml，置同一10 ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 　　2. 3 供试品溶液配制 　　取马钱子粉末(过三号筛) 约0. 6 g，精密称定，加氢氧化钠试液3 ml，放置30 min，加入甲醇20 ml，称重，置水浴中回流提取2 h，放冷、然后甲醇补足重量，离心过滤，取定量续滤液用0. 22 mu;m 滤膜过滤，即得粗提品。将粗提品用氮气挥干，然后用与挥干前等量的水溶液复溶，加入2% 的甲醇助溶，即得到上样液。 　　2. 4 毛细管整体柱制备 　　整个制备过程主要是采用热引发聚合反应。首先是在活化的毛细管内壁修饰甲基丙烯酰氧基甲基三乙氧基硅烷，配制聚合液，即取单体AA 56 mg 和4-VP 57 mg，交联剂63mg，致孔溶剂DMSO 380 mg，月桂醇170 mg，引发剂AIBN 2mg，超声(300 W，25 kHz) 混合脱气10 min，将溶液通入10cm 的毛细管，然后将管两端封口60 ℃ 反应18 h，聚合反应完成之后，用甲醇冲洗出未反应的试剂，最后一次用乙腈、缓冲液对整体柱进行平衡。 　　2. 5 萃取条件考察及优化 　　2. 5. 1 样品pH 对萃取效果的影响不同基底pH 可能使样品中待测成分带上不同的电荷，因而会对毛细管整体柱的萃取效果产生影响。试验考察了复溶溶液pH 4 ～ 9 条件下两个待测成分的峰面积变化，结果显示在pH 为8 的条件下，萃取柱