生物化学第四章酶研究报告.ppt

胰蛋白酶原 胰蛋白酶 六肽 肠激酶 活性中心 胰蛋白酶原的激活示意图 概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）。乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶。 生物学功能 ?遗传的标志 ?和个体发育及组织分化密切相关 ?适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不 同需要 同工酶(isoenzyme) 乳酸脱氢酶同工酶形成示意图 多肽 亚基 mRNA 四聚体 结构基因 a b 乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱 + – H4 MH3 M2H2 M3H M4 点样线 不同组织中LDH同工酶的电泳图谱 LDH1(H4) LDH2(H3M) LDH3(H2M2) LDH4(HM3) LDH5(M4) 心肌 肾 肝 骨骼肌 血清 - + 原点 同工酶在各学科中的应用 (1) 遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。 (2) 发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。 (3) 生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。 （4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。 抗体酶 抗体酶（abzyme）又称催化抗体（catalytic antibody）,是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。 抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子向结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能,达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。 O – C – A. 酯酶的底物–酯 B.酯的羰基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态 C.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物 磷酸酯类似物(半抗原) 对酯水解反应有催化作用的单克隆抗体 免疫 免疫反应 诱导法制备具有酯酶活性的抗体 基因工程抗体酶的制备 对已产生的单抗，分析氨基酸的组成或相应基因的碱基序列，对抗体结合的部位的基因进行定位突变，在抗体结合部位换上有催化活性的氨基酸，基因工程的技术使得建立抗体基因的组合文库，并根据需要构建适当程序的基因片段成为可能。 抗体酶的筛选 在抗体酶研究中，一个不可少的步骤是在细胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的细胞克隆，再从纯化的抗体中筛选出有催化能力的单抗。主要筛选方法有生物学筛选法和纯化学筛选法。 抗体酶的研究和应用前景 催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。 目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。 充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。 抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。 六.酶的分离纯化及活力测定 1.酶在细胞中的分布： 胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。 胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。 2.分离材料： 动植物原料或微生物的发酵液。微生物发酵液是用于分离酶的最常用材料，因为微生物种类多，繁殖快，培养时间短，含酶丰富。由微生物发酵产生的酶或其它生物组织中的酶因含有大量的其它物质，所以必须经过分离、提纯、结晶等阶段才可做实际应用。 对于某种酶的具体制备方案，应通过了解酶的来源、性质及纯度需要来确定，无固定的方案。 3.原则： 在增加酶得率和