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设计性实验-多糖的定性与定量 第一部分 多糖的鉴定，纯化与含量测定-----蒽酮比色法 一、目的： 掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。 二、原理： 糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收，在150 μg/ml范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。 这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30 μg左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器：电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等 2.试剂： (1)葡萄糖标准液：l00 μg/ml (2)浓硫酸 (3)蒽酮试剂：0.2 g蒽酮溶于100 ml浓 H2SO4中。当日配制使用。 四、操作步骤 1.葡萄糖标准曲线的制作 取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液： 管号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖标准液（ml） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸馏水（ml） 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 葡萄糖含量（μg） 10 20 30 40 60 80 在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0 min取出，用冰浴冷却至室温，在620 nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量（μg）2.1.1 Savage法将多糖粗品稀释成1.5%的水溶液400mL，加人100 mL氯仿/丁醇混合液(体积比4，1)，充分振荡使蛋白质析出，以2 000 r/min离心30 min，除去沉淀，将上清液再用此方法处理，重复7次.最后得到脱去蛋白的上清液.将该上清液逆向流水透析3d，将其减压浓缩至200 mL左右，加人2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置过夜，使普鲁兰多糖沉淀，沉淀液以4 500 r/min离心30 min，将沉淀用丙酮、乙醚依次洗涤，P205干燥 2.1.2 DEAE一纤维素柱层析将经Savage法除蛋白的多糖粉末溶于10m L蒸馏水 中，进行DEAE一纤维素(硼酸型)柱层析(3.3 cm X 40 cm)，洗脱速度为1 mL/min.首先用蒸馏水洗脱，分部收集(每管5 mL)，用改良的苯酚一硫酸法比色鉴定多糖部分，收集多糖峰，减压浓缩、透析、冷冻干燥得4.2g样品1.该层析柱用0.12 m ol/L硼砂洗脱，洗脱曲线如图2所示.同样收集多糖峰，浓缩、透析、冷冻干燥得1.5 g 样品 2.1.3 SephadexG -100柱层析分别取样品进行SephadexG -100柱层析(1C MX 100c m),进样量为0.5 m L，样品质量分数为0.70 o，用蒸馏水进行洗脱，洗脱速度 为4 mL/h，用改良的苯酚一硫酸法比色鉴定多糖部分，各有一个洗脱峰，收集洗脱峰后分别冷冻干燥得白色粉末 3.判别 参照步骤1，用显色反应判断样品是否为多糖。 4.测定 吸取1 ml已稀释的提取液于试管中，加入4.O ml蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（μg））───────────── × 100 W × V测 × 106 其中：C——在标准曲线上查出的糖含量（μg）总体积（ml）测定时取用体积（ml）D——稀释倍数W——样品重量（g）106——样品重量单位由g换算成μg的倍数 第二部分 多糖组分的检测-----TLC分析法 1 材料与方法 1．1 药品与材料 多糖；D．葡萄糖、D．半乳糖，D．木糖、L．鼠李糖、D．果糖上海试剂二厂；盐酸、乙酸乙脂、口}匕啶、无水乙醇、正丁醇、丙酮、正丁醇、异丙醇、醋酸、磷酸、硫酸、苯胺、二苯胺皆为分析纯试剂；实验用水为蒸馏水。 微量定量点样毛细管美国科尔帕默公司；20cm×20cm 硅胶层析板德国默克公司。 1．2 单糖和混合单糖标准溶液的配置 分别称取果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖，分别溶于蒸馏水中制得五种单糖标准液。浓度均为1．00m/m1。 分别称取葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、鼠李糖，共溶于2m1蒸馏水制得混合单糖标准液。各单糖在混合单糖标准液中的浓度为O．50mg/ml。 1．3 水解多糖样品的制备 多糖样品液加入12mol／L的HCI O．25ml，置于高压釜中在120～126℃条件下水解4h。中和、透析后稀释至10ml。 1．4 展开系统配置 展开系统1：分别把乙酸乙脂、吡啶