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层析技术  层析技术的原理 层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。 亲和层析法 亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。 离子交换层析法 　离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 * * * * * * * * * * * * * * 按两相所处状态分类 ? 流动相 液体 气体 ? 液体 液-液层析法 气-液层析法 固定相 ? ? 固体 液-固层析法 气-固层析法 按层析原理分类 　　　名称 　　分离原理 吸附层析法 组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同 分配层析法 各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同 离子交换层析法 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离 按操作形式不同分类 名称 操作形式 柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离 薄层层析法 将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离 纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离 薄膜层析法 将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离 　 亲和层析可用于纯化生物大分子：稀溶液的浓缩；不稳定蛋白质的贮藏；从纯化的分子中除去残余的污染物；用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子；分离核酸是亲和层析应用的一个重要方面。 ⒈离子交换剂预处理和装柱? 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎 的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。 ⒉加样与洗脱? 加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。 最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算： C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1