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生 物 化 学 实 验 四、实验室规则 1.穿工作服。 2.严格按操作规程使用仪器设备。 3.实验完毕后，洗净所用器材。 4.每次一个实验小组(轮流)做清洁卫生。 五、实验报告的书写 实 验 名 称 1.目的要求 日期 2.实验原理 3.主要方法及仪器 4.基本操作过程 5.现象与绘图 6.计算或结果 7.意义 8.注意事项 9.讨论与小结 10.思考题 实验一 分光光度法 一、实验目的： 掌握分光光度法的概念、基本原理和应用；并通过实验理解分光光度计的操作方法和步骤以及了解分光光度计的主要组成部件与工作原理。 单色光与复色光 单色光: 仅具有某一波长的光，由具有相同能量的光子所组成。 复色光: 与上相反，各种人眼可见的色光都属复色光。 二、分光光度法的概念 分光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法（也称为吸光光度法）。 在分光光度计中，将不同波长的光连续照射到一定浓度的样品溶液时，便可得出与不同的波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线可以进行物质定性、定量分析。 特点 —灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L, 10-4%～10-5% 准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差2～5％ （1～2％） 操作简便快速 应用广泛 三、分光光度法基本原理 1.物质对光的选择性吸收 吸收(absorption): 一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。 当依次将各种波长的单色光通过某一有色溶液,测量每一波长下有色溶液对该波长光的吸收程度(吸光度A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为该溶液的吸收光谱。 物质对不同的色光能有选择性的吸收, 即一定的物质主要吸收一定波长的光(互补吸收)，是因为物质本身的分子、原子都处在一定能级的运动状态，当物质吸收了光的辐射能以后，会产生能级的跃迁，产生吸收光谱。 2.光吸收基本定律 根据吸收光谱的特性和形状可作该物质的鉴别、纯度检查和初步的结构分析等。但是可见／紫外吸收光谱主要应用在定量分析方面，其定量基础即为Lamber-Beer定律，是说明吸光物质对单色光吸收的强弱与该物质的浓度与厚度间关系的定律。 透光度T(%)与吸光度A 吸光度与光程（厚度：L）的关系 A = KLc 吸光度与浓度的关系 A = KLc 四、 分光光度计的基本结构 分光光度计的基本结构 722型分光光度计结构方框图 在分光光度计上外来光源（混合光）通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.即将混合光中某一波长的单色光分出，故称为“分光”。 优点：波长可调, 故选择性好, 准确度高. 光源必须具有稳定的足够强度的连续光谱。 可见光分光光度计的光源通常为白灼钨灯，其光谱范围为320nm---2500nm。 紫外分光光度计的光源是低压氢弧灯，其光谱范围为150nm---400nm。 单色器是将复杂的白光分散成单色光的装置，其过程为光的色散。色散后的单色光经反射、聚光，通过狭缝到达溶液。 常用的单色器是棱镜或光栅。 也叫比色皿,比色杯，用来盛被测试的溶液。可见光区使用玻璃制的比色皿，紫外光区使用石英制的比色皿。因为玻璃会吸收紫外线。 吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。 即光电转换元件，为光电管或光电倍增管，可将透过比色皿的光信号变成可测量的电信号。 5. 显示仪表或记录仪 可直接读到结果，如检流计，微安表。 五、定量分析方法 ㈠ 标准曲线法 几点注意： 理想的标准曲线应为：用不同浓度标准溶液所测得的吸光度对浓度作图时，是一条斜率接近于1通过原点的直线； 标准溶液浓度范围应在被测物质浓度的一半到二倍之间； 吸光度在0.05---1.0之间为宜。 ㈡ 对比法 将标准与样品分别在相同条件下显色，测定其吸光度。因是相同物质在相同条件下测定，故可按下式计算出样品的浓度： 六．显色反应条件的选择 　　　对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。 这些显色反应，必须满足以下条件： 1．反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的