基于色谱-质谱的蛋白质组绝对定量新方法和新技术-生物分子高效.doc

国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）课题年度报告 项目编号：2012CB910600 项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究 按照按任务书的要求本课题在20年度主要针对1）建立了内标肽段制备、表征和含量测定；2））（MRM）））MALDI-MS技术的金属元素标记多重相对定量方法研究。按项目任务书的规定，完成了研究内容和预期目标。（MRM）（iSIM）（iSIM）结果表明该方法具有更高的分析灵敏度可以对低至1fmol BSA样品中的母子离子对进行确证而且相对于触发采集二级图谱方法而言具有更高的分析通量为规模化母子离子对选择与确证提供了一种新的策略pH 短梯度快速反相分离，在6-24 小时内，假阳性率低于1％条件下，可实现对6000-9000 个蛋白质的分析鉴定。 2）建立了一种基于纳米金和氧化石墨烯的改进的western blotting方法，可以对更低浓度的蛋白质进行检测，进而实现定量的目的。3）发明了5种固定化酶反应器。基于原子转移自由基聚合反应（ATRP），研制了四氧化三铁磁性纳米颗粒固定化酶反应器、新型鳞片状聚合物修饰硅胶填料固定化酶反应器、毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化酶反应器和原子转移自由基聚合修饰（ATRP）银丝固定化酶反应器，应用磁性纳米颗粒固定化酶反应器进行18O标记并成功应用于腾冲嗜热菌全蛋白复杂体系中烯醇化酶目标蛋白质的绝对定量。以开管毛细管为载体，在毛细管内壁上逐步合成树枝形大分子聚酰胺胺（PAMAM）制备了多层酶反应器，具有较高的酶切效率、适用性和稳定性。 在糖肽的多反应检测质谱相对定量分析方法研究及应用方面，建立了基于MRM技术的蛋白质核心岩藻糖基化水平相对定量的策略，结合18O稳定同位素标记技术，对健康血清和肝癌血清中6个生物标志物候选蛋白质7个核心岩藻糖基化位点的修饰变化水平进行相对定量检测。 在基于MALDI-MS技术的金属元素标记多重相对定量方法研究方面，建立了基于质谱技术和针对多肽N-端氨基标记的金属元素标记蛋白质组多重定量新方法，并成功地初步应用于四个不同温度培养的腾冲嗜热菌的差异蛋白组的研究。 共发表篇申请国家发明专利项。研究工作的主要进展50个肽段进行拼接翻译成相应的核苷酸序列，大肠杆菌A3047。酶切后通过质谱表征，实现了48个目标肽段的定性分析。对合成肽段的纯度进行的色谱及质谱分析，肽段的纯度均为90%以上，表明被测样品中残肽残留很少，可以在氨基酸水平上进行肽段含量测定。然后对肽段进行酸溶液水解条件进行优化。建立了氨基酸-同位素稀释质谱法测定合成肽段含量的方法。通过在水解溶液中添加同位素标记氨基酸校正了系统误差。采用不需要衍生化的同位素稀释MRM质谱法测定了合成肽段的绝对含量。该方法的精密度和准确度均满足定量要求。 2.2 建立了多肽、糖蛋白纯度和稳定性的毛细管电泳表征方法及蛋白质分子印迹光子晶体的制备方法 2.2.1建立了血管紧张素II (Angiotensin II) 多肽的纯度表征及稳定性考察方法 首先测得血管紧张素II的等电点为6.94。然后对电泳缓冲液和pH进行选择。考察了磷酸盐缓冲液、硼砂硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液对出峰时间、峰型、分离度等各个参数的影响。最终选择硼砂硼酸缓冲液，只有在硼砂硼酸缓冲液下，才能明显看到杂质峰。以此为条件，考察溶液pH对分析的影响。pH 8.7时，杂质峰非常明显。考察了样品存放的缓冲液pH和离子强度影响，随着样品缓冲液pH升高，样品的出峰没有明显变化。在样品缓冲液中加入NaCl，随NaCl浓度增加，样品峰高显著降低，峰型变宽。可能是由于样品缓冲液与运行缓冲液的离子强度差异减小，富集作用降低。在优化条件下对多肽的纯度进行测定，在pH8.2-9.0范围可得到杂质峰与肽的高分辨分离。在pH8.7时，采用校正峰面积和峰面积归一化方法计算得到的纯度值分别为：88.76%/91.40%；89.37%/89.09% 91.08%/90.83%2%的数值差异。供货商提供验证报告为HPLC图的归一化处理方法，说明毛细管电泳方法与HPLC相比存在差异，后续需对毛细管电泳方法进一步研究，评价其优劣。最后在不同温度下，不同放置时间，对多肽的稳定性进行了比较。 2.2.2 建立了糖蛋白人凝血酶、牛凝血酶、辣根过氧化物酶和凝集素的稳定性表征方法 牛凝血酶放置温度和时间影响其蛋白形态，其出峰数，峰高有变化。人凝血酶随放置温度不同和放置时间增加，稳定性变化，在室温条件下，峰形、峰高和峰面积都明显改变，稳定性逐步降低。植物蛋白凝集素随放置稳定和放置时间变化，稳定性基本保持，电泳图中无明显出峰数和峰高变化。辣根过氧化物酶随放置时间增加，在室温下，峰形、峰高和峰面积都有所改变，稳定性降低。 2.2.3 初步建立分子印迹光子晶体检测蛋白质的方法