基因工程菌发酵液.ppt

第五节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。 一、菌体的生长与能量的关系 碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用 分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。 大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。 二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。 基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。 质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延深过程减少转录。 它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。 第六节 基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。 质粒不稳定可分为： 　　分裂不稳定 　　结构不稳定 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定 比例不含质粒子代菌的现象。 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素： ⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； ⑵这两种菌比数率差异的大小。 对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。 质粒稳定性的分析方法 样品 二、提高质粒稳定性的方法 为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达 由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。 调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度 有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的和成和菌体的生长。 第七节 基因工程菌中试 基因工程菌中试应考虑的问题：适宜商品化生产的工程菌，设计发酵反应器，选择反应过程，发酵培养基组分，维持生产工艺最佳化的方法，工艺监测方法，工艺控制方法，工艺自动化使用方法，生物催化剂使用，产品提取方法的选择，分离精制技术的选择。 一 工程菌选择 用于中试的工程菌需具备的条件试能用一般基因重组技术获得，有高产潜力，能有工业原料薇培养基，生产工期能采用一般工业生产经验，能产生和分泌蛋白质，不致病，无毒性，能安全生产，符合国家卫生部门有关规定，产品有特异性，发酵液粘度小。 二 反应器设计 三 发酵培养基组成 培养基组成及作用： 提供化学元素 提供特殊营养源 提供能源 控制代谢 四 工艺最佳化与参数监测控制 1.工艺最佳化 是指最快周期，最高产量，最好质量，最低消耗，最大安全性，最周全的服务处理效果，最佳化速度与最低失败率等的综合