基因引物设计课件.pptVIP

常用实验技术简介 黄雪娜 2011-8-4 目 录 全长cDNA克隆 引物设计 染色体步移技术 全长cDNA克隆 是许多后续更深入实验的基础； 真核生物mRNA的特征及转录过程的了解； 全长cDNA克隆方法：灵活掌握； 同源克隆技术 RACE-PCR技术 基因克隆前的准备工作 看有没有被别人克隆出来； 查看文献了解基因的功能及表达特征； 了解该基因可能涉及的工作（如激酶活性的测定及DNA-蛋白相互作用等），制定计划； 了解相近物种该基因的信息，以利于扩增过程中预测PCR的延伸时间； 同源片段的克隆 本实验室的EST数据库； NCBI数据库； RT-PCR用兼并引物扩增同源片段； 设计兼并引物是重点！！！！！ 注意事项： 高质量的mRNA和高效率的逆转录； 加大引物浓度； 选择mRNA表达量高的组织做模板； 梯度PCR或者降落PCR； 巢氏PCR; 序列分析； 3’RACE: 原理： 5’RACE 原理： 注意事项： RNA的完整性； 高效的逆转录酶； 多次5’RACE相结合； 应用丰度高的组织做模板； 长片段扩增应用LA-Taq酶； 同源克隆方法； 用随机引物或者OligoT引导逆转录； 序列分析 引物设计：Primer 5.0； 一般的序列处理：DNAStar中的Editseq； 序列拼接： DNAStar中的Seqman、BL2； 序列在线比对：NCBI-BLAST ( / )； 序列多重比对：Bioedit、ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)； 寻找ORF: Editseq、ORF Finder ( /gorf/gorf.html )； 序列作图：Bioedit、EMBOSS ( http://emboss.bioinformatics.nl/ )； 构建进化树:MEGA 4.1； 蛋白结构域分析：SMART( http://smart.embl-heidelberg.de/ )； 蛋白理化性质分析及二、三级结构分析：EXPASY( http://www.expasy.ch/tools/ )、Psipred ( http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ )； 信号肽分析：SignalP( http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )； 磷酸化位点分析：NetPhos 2.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )； 糖基化位点：NetNGlyc 1.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ )； 引物设计 兼并引物 RACE引物 荧光定量引物 染色体步移引物 原核表达用引物 PCR-SSCP引物 总原则 ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5′端可以修饰。 ⑨ 引物3′端不可修饰。 ⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。 兼并引物 兼并碱基： M=A/C? ???R=A/G? ? W=A/T? ???S=G/C? ???Y=C/T?K=G/T? ? V=A/G/C? ???H=A/G/T? ? D=A/G/T? ? B=G/C/T N=A/G/C/T 简并度： 兼并引物设计步骤 利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 对所找到的序列进行多序列比对 确定合适的保守区域 设计兼并引物（软件或者人工） 选择合适的序列进行多重比对； 选择高度保守的序列作为引物； 人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还是反向互补的； 简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N； 引物的3‘端残基尽可能使用确定残基 ； 降落PCR; 巢氏PCR; RACE引物 各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp； 若同源片段长度太短，可先做3’RACE，再做5’RACE； 尽量靠近cDNA末端（3’RACE-3’末端； 5’RACE-5’末端）； 荧光定量引物 纯化方式：PAGE； 产物长度：80-150bp； TM值:58-62; 在编码区内靠近3’末端处设计； 高的特异性：测序及熔解曲线分析； 染色体步移引物 以DNA为模板设计引物； 3条重叠引物； 高的退火温度：高于60度； 原核表达用引物 会读表达载体图谱； 去除信号肽序列； 根据目的表达序