海洋大分子的分离纯化及研究方法.ppt

* * * 原因 * 超声，细胞裂解液，液氮 * 接近细胞生理条件（比如 pH≈7.0，0.15 mol/L NaCl）对于提取大多数蛋 白质都很有效。因此常常选用 pH 7.0~7.5，20~50 mmol/L 磷酸盐缓冲液或 pH 7.5， 0.1 mol/L Tris-HCl（含 0.05~0.15 mol/L NaCl）缓冲液提取蛋白质 * * 为避免提取过程中蛋白质的降解，提取一般为低温环境操作，另外加入蛋白酶抑制剂也 能有效防止蛋白质的降解（蛋白酶抑制剂包括 PMSF、EDTA，antipain和 leupeptin 等）。 * 7%PEG沉淀血清蛋白，然后在TBS中溶解蛋白 * 对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的热动力学这种的结果。 虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表明形成疏水区域， * 在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用。用高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。 * * （2）有机溶剂沉淀法 与盐析法相比，有机溶剂沉淀法的优点是：①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。其缺点是容易引起某些具有生物活性的蛋白质变性失活，操作需在低温下进行。 蛋白的粗分级 （2）有机溶剂沉淀法（优点） ①温度：蛋白质在有机溶剂中对温度特别敏感，操作应在低温下进行，以免蛋白质变性。 ②样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。 蛋白的粗分级 （2）有机溶剂沉淀法（优点） ①温度：蛋白质在有机溶剂中对温度特别敏感，操作应在低温下进行，以免蛋白质变性。 ②样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。通常蛋白质的初浓度5mg/mL～20mg/mL为宜。 蛋白的粗分级 （2）有机溶剂沉淀法（优点） ③ pH值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。 ④ 离子强度：少量的中性盐对蛋白质有良好的保护作用，但盐浓度以不超过5％为宜，否则会降低了沉淀效果。 蛋白的粗分级 （3）等电沉淀法 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。它是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。 蛋白的粗分级 （3）有机聚合物沉淀法 有机聚合物最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于酶的纯化。其中应用最多的是聚乙二醇(Polyethylene Glycol，简写为PEG)，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在蛋白质纯化中，用的较多的是分子量为6000～20000的PEG。 蛋白的粗分级 （3）有机聚合物沉淀法 本方法的优点是：①操作条件温和，不易引起蛋白质变性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的蛋白质分子。③沉淀后有机聚合物容易去除。 蛋白的粗分级 （1）凝胶过滤 这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。凝胶的种类有很多，葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、Sephacryl、Superdex等，每种凝胶均有分离范围不同的多种型号，几乎可以分离纯化任意大小的多肽和蛋白质。 蛋白的细分级 （2）离子交换层析 由于蛋白质为两性分子，所以可用离子交换层析来分离纯化。广泛用于蛋白质分子层析的支持介质是离子交换纤维素和离子交换葡聚糖等亲水性离子交换剂。 蛋白的细分级 （3）吸附层析 使用最广和最有效的吸附剂是结晶磷酸钙[Ca10(PO4)6(OH)2]，即羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）。蛋白质分子中带负电荷的基团与HA的钙离子结合。蛋白质可用磷酸缓冲液从羟基磷灰石柱上洗脱下来。 蛋白的细分级 （4）疏水层析 疏水作用层析（HIC），从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析。HIC是根据有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性进而将有效成分分离出来的一种层析技术。 蛋白的细分级 （4）疏水层析 在HIC过程中，所用的固定相一般是由基质和配基（疏水