现代分子生物学课件-10.ppt.ppt

YAC优缺点： 优点：容量大，是迄今容量最大的克隆载体，插入片段平均长度为200-1000kb，最大可达2Mb。 缺点：嵌合体多，分子克隆不稳定，难以与酵母染色体分开。 “全基因组鸟枪法测序”也称“霰弹法”，最早是美国塞莱拉公司使用的快速测序手段，是将基因组ＤＮＡ打成小片段进行测序，然后再将这些小的片段拼接起来，重新组装成一个完整的基因组。它取代了对染色体各部分逐个的测序，整个基因组被切成许多小段，然后再由可能寻找重叠部分的高速计算机将这些零碎的碎片拼接起来，就像解决一个很复杂的谜题。它的最大优点是经济、快速、高效，但对高性能计算的方法和设备要求非常高。 随机扩增多态DNArandom amplifide polymophic DNA , RAPD ? ? 随机扩增多态性(RAPD)标记：RAPD是通过短的随机引物扩增个体基因组DNA体 现多态性 ? ? ? ? 微卫星多态性标记(STRP) 基于PCR技术的DNA标记，多态性是由同一座位上的串联单元数量的不同而产生的。  单核苷酸多态性标记(SNP) 将被测DNA片段与高密度DNA探针(中部单核苷酸 替代探针)微阵列杂交，一次性快速显示被测序列的单核苷酸多态性，并通过计算机分析 。 DNA芯片(DNA chip) 又称DNA微阵列，是 指固着在固相载体上的高密度DNA微点阵。 10. 3比较基因组学（Comparative genomics）及功能基因组学研究 比较基因组学： 比较不同基因组间差异的学问。 通过对系统发育中代表性物种全方位基因和基因家族的比较分析，构建系统发育的遗传图谱，揭示基因、基因家族的起源和功能及其在进化过程中复杂化和多样化的机制。 基因组的序列可被分为三类： （一）通过比较确知其生理功能的； （二）在数据库中有相匹配的蛋白质序列，但并不知道其功能的； （三）在现有数据库中找不到任何相匹配的蛋白质序列的新基因。 10. 3. 3 功能基因组学研究 功能基因组学(Functional genomics) 又称后基因组学，它利用结构基因组提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。 研究内容 基因功能的发现、基因表达分析及突变检测。 基因功能包括： 生物学功能、细胞学功能、发育上功能。 采用的新技术： 减法杂交、差示筛选、基因表达系统分析 （SAGE)、cDNA微阵列、DNA芯片 人类和各种模式生物的全长cDNA克隆对基因的发现及功能分析都极为有用，因此，获得全长cDNA的技术和发现稀有转录物的技术都将被放在高度优先的地位。 cDNA RACE(cDNA末端快速扩增) 是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。 1. 在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成 2. RNase混合物降解模板mRNA，纯化cDNA第一条链。 3. 用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP 4. 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，以期得到目的片段，并可用nest PCR进行检测。 5’ RACE 1. 在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。 3’RACE 2.用RNaseH 降解模板mRNA。 3. 用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3’片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩增。 10. 3. 1 通过基因组数据进行全局性分析 低等真核生物如酵母、线虫以及高等植物拟南芥，不但基因组比较小，基因密度比较高，百万碱基对中含有200个或更多的基因，基因组90%以上由常染色质组成。 ? 图10-17 部分典型真核和原核生物基因组成份分析。 人?-T细胞受体位点，在50kb大片段中只有一个基因（TRY4，编码胰蛋白酶原），一个假基因（TRY5），两个基因片段（V28，V29-1）和52个存在于全基因组范围内的重复序列，编码功能基因的序列占总序列不到3%。 B. 酵母第Ⅳ号染色体中的一个片段，其中包括26个蛋白质编码基因，2个tRNA基因，5个存在于基因组范围内的重复序列，编码功能基因的序列占总序列的66.4%，重复序列占13.5%（在所有16条酵母染色体中，重复序列只有3.4%）。在该50kb序列中，所有基